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Für welche Applikationen kann ich synthetische Gene verwenden?
Synthetische Gene können beispielsweise für die Anpassung der Codon Usage zur Optimierung der Gen-Expression, zur Überexpression von Proteinen, für Protein-Engineering, sowie als Standards für Real Time PCR und PCR-Analysen verwendet werden. Synthetische Gene können auch zur Konstruktion von Hybrid-Genen oder zur Produktion von DNA-Impfstoffen dienen. Weiterhin können multiple Varianten eines Gens hergestellt werden.
Was sollte bei dem Design eines Gens berücksichtigt werden?
Die gewünschte Sequenz, welche beispielsweise für ein künstliches Protein kodiert, wird in eine Reihe von überlappenden Oligonukleotiden unterteilt. Um das bestmögliche Ergebnis zu erzielen, sollte die Sequenz der zu assemblierenden Oligonukleotide sorgfältig unter Einhaltung folgender Gesichtspunkte gewählt werden:
- die Bildung von Hairpin-Strukturen innerhalb der Oligonukleotide sollte vermieden werden
- wenn hohe Expressionsraten erwünscht sind (beispielsweise für die Protein-Produktion) sollten Sequenzen vermieden werden, die seltene Codons in ein Gen einführen
- Oligonukleotide mit eindeutigen Restriktionsschnittstellen können für anschließende Manipulationen durch rekombinante DNA-Techniken von Vorteil sein.
Eurofins Genomics verwendet die urheberrechtlich geschütze Software GENEius für das Design der Oligonukleotide.
Welche verschiedenen Assembly-Techniken sind möglich?
Grundsätzlich gibt es drei verschiedene Ansätze für das Assembly synthetischer Gene.
In dem von Khorana (Gupta et al. 1968) entwickelten Ansatz wird eine Reihe von überlappenden Oligonukleotiden synthetisiert. Durch das Annealing der Oligonukleotide, bildet sich ein doppelsträngiges DNA-Fragment mit vereinzelten Lücken in beiden Strängen. Diese Lücken werden anschließend mittels einer DNA-Ligase geschlossen. Die DNA-Ligase ist ein Enzym, das eine Phosphordiester-Brücke zwischen dem 5`-Phosphat eines doppelsträngigen Oligonukleotidfragments und dem 3`-Hydroxyl-Ende eines anschließenden doppelsträngigen Oligonukleotidfragments bildet.
Ein zweiter, häufig angewandter Ansatz wurde von Narang (Scarpulla et al. 1982) entwickelt. Diese Methode macht sich der Template-gerichteten, Primer-abhängigen 5’-3’-Synthese-Fähigkeit der DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) zu Nutze. Nach Annealing der Enden der langen Oligonukleotide, füllt die Polymerase die Lücken mit dNTPs auf. Vereinzelte Lücken im Doppelstrang werden anschließend mit DNA-Ligase geschlossen.
Eine alternative Strategie basiert auf der Möglichkeit, sehr lange Oligonukleotidketten herstellen zu können. Bei diesem Ansatz (Rossi et al. 1982) werden zwei Oligonukleotide mit überlappenden 3’-Enden konstruiert. Dieses Konstrukt wird durch die DNA-Polymerase zum Doppelstrang vervollständigt. Nach der Polymerisation können überhängende Enden mittels Restriktionsverdaus generiert werden.
Gewöhnlich werden neu synthetisierte Fragmente und Gene anschließend in einen Vektor kloniert. Zu diesem Zweck ist es notwendig, bei dem Oligonukleotid-Design alle Klonierungsschritte zu beachten. Größere Fragmente können in Untereinheiten unterteilt werden, welche dann separat assembliert werden. Nach der Verifikation der Sequenzen der Untereinheiten werden diese zum Gesamtfragment assembliert.
Ist eine ortsgerichtete Mutagenese oder eine De Novo Synthese zu bevorzugen?
Wenn die Mutationen zahlreich und über die gesamte Sequenz verteilt sind, empfehlen wir die
De Novo Synthese. Die De Novo Synthese ermöglicht es zusätzlich, andere Eigenschaften der Sequenz anzupassen bzw. zu optimieren, wie beispielsweise die Codon Usage, den GC-Gehalt oder Restriktionsstellen.
Die ortsgerichtete Mutagenese ist anzuraten, wenn nur wenige Modifikationen vorliegen und/oder diese in einem eng begrenzten Bereich innerhalb der Sequenz gebündelt sind.
Wie kann das Molekulargewicht eines Plasmids bestimmt werden?
Jedes bp hat ein spezifisches Molekulargewicht - im Durchschnitt 0,65 Kilodalton. Für ein Plasmid mit 3.000 bp Länge kann das Molekulargewicht wie folgt berechnet werden: 3.000 bp x 0,65 kD pro bp = 1.950 kDa.
Wenn Sie ein synthetisches Gen mit beispielsweise 1.000 bp Länge bestellen, ist dieses in unseren Standardvektor pEX-A2 (2.450 bp) kloniert. Das Molekulargewicht für das entsprechende 3.450 bp Plasmid beträgt dann 2.243 kDa.
Können Gene und GeneStrands als qPCR Kontrollen verwendet werden?
Ja. Synthetische Gene und GeneStrands werden auf offenen Robotor produziert. Hier kann man die Möglichkeit einer sehr geringen Kreuzkontamination in seltenen Fällen nicht ausschließen. Wir haben einen täglichen Reinigungs- und Dekontaminationsprozess entwickelt, der solche Fälle so gut wie möglich ausschließen soll. Sollten Sie allerdings mehrere qPCR / sensitive PCR Kontrollen in einer Bestellung haben, empfehlen wir, uns vor der Bestellung zu kontaktieren, um ihre Anforderungen vorab zu besprechen.