• Synthese von einzelsträngiger RT-PCR aus einer RNA-Vorlage mittels reverser Transkription unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits.
  
  
• Synthese von doppelsträngiger RT-PCR aus einer RNA-Vorlage mittels reverser Transkription unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits.

PCR-Primer-Design und -Synthese

Die bereitgestellten Sequenzdaten werden verwendet, um die geeigneten Primer für die PCR-Reaktionen und die anschließende Sequenzierung zu entwerfen. Alle Primer werden optimiert, und ihre physikochemischen Eigenschaften – wie GC-Gehalt, Tm und Selbstanlagerung – werden von unserem Expertenteam überprüft. Die Primer werden anschließend intern synthetisiert.

PCR und Aufreinigung

Die PCR-Reaktionen werden auf standardmäßiger genomischer DNA (sofern verfügbar) oder alternativ auf einer oder zwei der vom Kunden bereitgestellten genomischen DNA-Proben durchgeführt. Die PCR-Produkte werden anschließend aufgereinigt und mittels Agarose-Gelelektrophorese einer Qualitätskontrolle unterzogen. PCR-Produkte mit unzureichenden Ergebnissen werden in einem zweiten und, falls erforderlich, dritten Durchlauf erneut erzeugt. Dies umfasst jeweils ein neues Primerdesign für jedes PCR-Produkt, die Primersynthese, PCR-Amplifikation sowie die Aufreinigung der PCR-Produkte.

Sequenzierung der Test-PCR

Zur Sicherstellung der Qualität des PCR-Prozesses werden alle etablierten PCR-Reaktionen anschließend von beiden Strängen (bidirektional) sequenziert.

Hochdurchsatz-PCR und Aufreinigung

Sobald die PCR-Primer erfolgreich entworfen wurden, werden PCR-Reaktionen mit allen DNA-Templates vorbereitet und mittels Hochdurchsatzverfahren durchgeführt. Die PCR-Produkte werden anschließend aufgereinigt.

Hochdurchsatz-Sequenzierung

Alle PCR-Produkte werden in doppelsträngiger oder auf Anfrage auch in einzelsträngiger Qualität sequenziert. Dieser Schritt umfasst die Wiederholung der Sequenzierungsreaktion im Falle eines Fehlversuchs. Sollten beide Reaktionen fehlschlagen, wird die Probe vollständig neu angesetzt.

Bioinformatik umfasst das hochwertige Trimming und die Assemblierung einzelner Reads sowie die Analyse von Sequenzdaten einzelner Gensegmente. Auf Anfrage verwenden wir die daraus resultierenden Konsensussequenzen, um eine Datenbanksuche (BLAST) durchzuführen und die biologische Klassifizierung jeder Probe zu bestimmen.

Wir vergleichen jede Sequenz mit einer vom Kunden bereitgestellten Referenzsequenz und analysieren diese, um potenzielle Sequenzunterschiede wie Heterozygoten, Insertionen/Deletionen oder Codonänderungen zu identifizieren.

Zur Erstellung eines umfassenden Mutationsberichts führen wir eine Analyse mithilfe geeigneter Software durch.

Alle Ergebnisse werden in Form eines Analysezertifikats (CoA) / eines umfassenden Berichts zusammengefasst und gemeinsam mit den Rohdaten bereitgestellt.

Sie erhalten folgende Rohdaten in Ihrem Online-Konto:

• *.ab1: Elektropherogramme im AB1-Format
• *.cons: Konsensussequenz im FASTA-Format (MS-DOS TXT)
• *.qual: Qualitätsbericht für jede Konsensussequenz (MS-DOS TXT)
• *.align: Alignment der einzelnen Reads zur Erstellung einer Konsensussequenz (MS-DOS TXT)
• *.comp: Alignment-Vergleich mit einer Referenzsequenz (MS-DOS TXT)
• *.mutation: tabellarische Zusammenfassung aller beobachteten Abweichungen von der Referenzsequenz (XLS oder MS-DOS TXT)

Analysezertifikat (CoA)

Ein formelles Dokument eines Labors, das die Ergebnisse, Spezifikationen und Methoden einer oder mehrerer Laboranalysen zusammenfasst. (Bioinformatische Analyse erforderlich)

Umfassender Bericht

Ein vollständiger, detaillierter Bericht gemäß Ihren Spezifikationen unter Bezugnahme auf die ISO-17025-Akkreditierung, der Informationen zu Materialien, Methoden und Ergebnissen enthält. (Bioinformatische Analyse erforderlich)

Die Sequenzierung erfolgt nach Standardmethoden und in Übereinstimmung mit:

CLSI-Richtlinie MM09-A; Vol. 34 Nr. 4, 2014; Nucleic Acid Sequencing Methods in Diagnostic Laboratory Medicine, Approved Guideline – Second Edition

Die Durchführung von Sequenzierungsstudien erfolgt gemäß:

OECD-Richtlinie ENV/MC/CHEM (98)17 (rev. 1999): The Principles of Good Laboratory Practice (Monograph Nr. 01) sowie OECD-Richtlinie ENV/JM/MONO(1999)23 (rev. 2002): Short Term Study and GLP (Monograph Nr. 07)

Qualitätssicherungsaktivitäten (QA) im Zusammenhang mit Sequenzierungsstudien (Überprüfung des Studienplans, Inspektion der Studie, des Studienberichts und der Rohdaten) werden gemäß:

OECD-Richtlinie ENV/CBC/MONO(2022)20: Quality Assurance and GLP (Monograph Nr. 23) durchgeführt.

Typische Anwendungen für Re-Sequenzierungs- / Sanger-Sequenzierungsprojekte sind:

✔️ Re-Sequenzierung viraler, chromosomaler oder komplexer DNA-Regionen

✔️ RNA-basierte Sequenzierungsprojekte (mRNA, virale RNA, Gesamt-RNA)

✔️ Bestätigung der Sequenzintegrität nach Prozessänderungen

✔️ Untersuchung unerwarteter Varianten oder Mutationen

✔️ Unterstützung regulatorischer Einreichungen und Audits

✔️ Lange oder problematische Regionen, die nicht durch Standard-Workflows abgedeckt sind

✔️ Dedizierte Projektunterstützung von Anfang bis Ende

Personalisierte Betreuung durch ein erfahrenes Projektteam in jeder Phase Ihres Sequenzierungsprojekts.

✔️ Breite Probenannahme

Verarbeitung von Probenmaterial bis zu Biosicherheitsstufen BSL1/S1 und BSL2/S2.

✔️ Primerdesign und -synthese inklusive

End-to-End-Unterstützung – von der Sequenzierungsstrategie bis hin zu Primerdesign und -synthese.

✔️ Erweiterte Bio-IT-Analyseoptionen

Umfassende bioinformatische Lösungen einschließlich Sequenz-Trimming, Assemblierung, Konsensusbildung und Mutationsanalyse:

• Zusammenführung von Sequenzdaten zu validierten Konsensussequenzen
• Qualitätskontrolle der Konsensussequenz einschließlich detaillierter Qualitätsberichte
  
  

✔️ Flexible Datenbereitstellung

Mehrere Datenformate und Bereitstellungsoptionen, individuell an Ihren Workflow angepasst.

✔️ Kostenlose Kurzzeitlagerung inklusive

Kostenlose Lagerung von Template-DNA und allen Primern für bis zu 3 Monate.

✔️ Außergewöhnliche Sequenziergenauigkeit

Verifikationsgenauigkeit von bis zu >99,99999 %, basierend auf dem Sanger-Goldstandard.