qPCR Biplex Assays Design Tool

Eurofins Genomics' qPCR Assay Design Tools verwenden das Prime+ Programm des GCG Wisconsin Package das für perfekten Sonden Design mit zusätzlichen Parametern erweitert wurde.

Das qPCR Assay Design Tool analysiert die eingegebene DNA Sequenz und ermittelt die optimalen Sonden / Primer Kombinationen. Zur Ermittlung der optimalen Sonden und Primer müssen bestimmte Parameter der Sonde, der Primer und des PCR Produkts berücksichtigt werden. Diese Werte sind bereits als Standard vordefiniert. Sie können entweder diese Werte für das Design verwenden oder entsprechende Parameter für eine individuelle Analyse verändern.

Zielsequenz
Kopieren Sie die Zielsequenz aus Ihrer externen Quelle in das Textfeld. Die Zielsequenz kann entweder als DNA Sequenz oder im FASTA Format (beginnt mit einem ">" gefolgt von einem Namen) eingegeben werden. Zeilenumbrüche und Leerzeichen sind erlaubt. Die Zielsequenz kann Regionen mit degenerierte Basen (Wobbles) enthalten, die jedoch nicht für das Sonden und Primer Design berücksichtigt werden.

Design Parameter
Das Design Tool verwendet standardmäßig die komplett eingegebene Zielsequenz. Sie können aber auch eine bestimmte Region für das Design definieren indem Sie die Anfangs- und Endposition festlegen. Falls Sie andere Basen als C/G am Primer 3' Ende oder eine andere maximale Tm-Differenz der Primer-Paare benötigen, können Sie diese spezifizieren.

qPCR Probe Kriterien
Für die Sonden können Sie die minimale und maximale Sequenzlänge sowie den GC-Gehalt festlegen. Homopolymer-Stretches und 5' Gs werden von der Software automatisch vermieden. Mehr Cs als Gs in der Sequenz werden für die Sonde berücksichtigt. Zusätzlich werden Sonden verwendet, deren Tm um 8-10°C höher ist, als die Ta des PCR Produktes.

Primer Kriterien
Sie können ein Minimum und Maximum für die Sequenzlänge, den GC-Gehalt und die Schmelztemperatur (Tm) der Primer festlegen. Die maximale Primer-Länge die Sie eingeben können ist 100 Basen. Die Primer Tm wird unter Verwendung des Nearest-Neighbor Modells von Borer berechnet. Desweiteren wird die Thermodynamik bei DNA Wechselwirkungen sowie die Salzabhängigkeit von Oligonukleotiden nach SantaLucia ermittelt [Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 95; 1460-1465 (1986)].Für eine effiziente Primer-Bindung, vermeidet das Tool das Design von Primer-Sequenzen mit Hang zu extensiven Self-Dimer und Cross-Dimer Bildungen um Sekundärstrukturen und Primer-Dimere zu verhindern.

Amplikon Kriterien
Für die PCR Produkte können Sie den Bereich der Produktgröße definieren, sowie Minimum und Maximum des GC-Gehalts und der Schmelztemperatur des PCR Produkts. Die maximal Produktgröße beträgt 5.000 bp. Die Tm Berechnung der PCR Produkte beruht auf der Formel von Baldino, et al. [in Methods Enzymol. 168; 761-777 (1989)] die ein wenig von Rychlik, et al. [Nucleic Acids Res. 18; 6409-6412 (1990)] modifiziert wurde.

Reaktionsbedingungen
Die Salzkonzentration spezifiziert die Salzkonzentration in mM in der Reaktion. Dieser Wert wird für die Berechnung der Schmelztemperatur für die Primer und der PCR Produkte verwendet. Der Standardwert beträgt 50.0, kann aber im Bereich von 0.1 to 50.0 mM liegen.
Die Primerkonzentration spezifiziert die DNA Konzentration der Primer in nM in der Reaktion. Dieser Wert wird für die Berechnung der Primer Tm verwendet. Der Standardwert beträgt 50.0, kann aber im Bereich von 0.1 to 50.0 mM liegen.

Klicken Sie auf den "Design qPCR Assay" Button. Sie erhalten eine Ergebnisliste geeigneter Sonden / Primer Kombinationen in der von Ihnen angegebenen Anordnung.