Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen

Unter den unten aufgeführten Bedingungenkönnen auch nur verkürzte Prüfberichte erstellt werden.

Betrifft: Vereinfachte Prüfberichte nach DIN EN ISO 170252018, (Abschnitt 7.8)

Prüflabore (Akkreditierung):  Eurofins Genomics Europe Applied Genomics GmbH (D-PL-13372, ) Eurofins Genomics Europe Sequencing GmbH (D-PL-17038)

Für akkreditierte Prüfungen bei diesen beiden Gesellschaften  werden Prüfergebnisse ggf. nur  vereinfacht berichtet, d.h. Anforderungen der Norm DIN EN ISO 17025:2018 (Abschnitt 7.8) sind für diese Art der Ergebnisübermittlung  nicht vollumfänglich  zutreffend.

Bei diesen Prüfungen können die Ergebnisse daher auch als Kurzprüfberichte, elektronisch erzeugten Result reports, Exceltabellen oder nur als Ergebnisdateien berichtet werden.

Bei Fragen dazu wenden Sie sich bitte an das Customer Care Team.

Einen Überblick über alle unsere Richtlinien zur Probenvorbereitung finden Sie hier >>

Bitte senden Sie Ihre Proben in barcode-beschrifteten 1,5 ml Safe-Lock-Tubes; oder bei > 48 Proben in einer "Eppendorf twin.tec PCR Plate 96, full-skirted", wobei die Positionen G12 und H12 leer bleiben müssen.

Ja, wir führen eine Qualitätskontrolle (QC) der Menge Ihrer Probe durch.

Wenn die Menge, Konzentration oder Qualität des Ausgangsmaterials nicht den Anforderungen für die weitere Verarbeitung entspricht, werden wir Sie kontaktieren, um das weitere Vorgehen zu besprechen. Falls möglich, wird Eurofins Genomics zusätzliche Vorverarbeitungsschritte empfehlen, um die Probenqualität zu optimieren.

Bitte wählen Sie den gewünschten Service aus (zum Beispiel im Schnellbestell-Menü oben auf der Seite) und folgen Sie den Anweisungen.

Abhängig vom ausgewählten Produkt müssen Sie möglicherweise zunächst ein Angebot anfordern.

Sobald Ihr Angebot verfügbar ist, werden Sie benachrichtigt und können es in Ihrem Konto akzeptieren (navigieren Sie dazu bitte zu „Konto“ -> „Angebote“).

Im Bestellprozess werden Sie aufgefordert, Ihre Proben über unser Sample Submission Sheet hochzuladen. Die Möglichkeit, das Formular herunterzuladen, finden Sie direkt neben der Upload-Schaltfläche (laden Sie das Formular bitte immer hier herunter, da es je nach angebotenem Produkt unterschiedlich sein kann). Dieses Formular erfordert, dass Sie uns weitere Informationen zu Ihren Proben bereitstellen und Eurofins NGS Barcode-Etiketten Ihren Proben zuweisen.

Unsere Eurofins NGS Barcode-Etiketten können (kostenlos) auf unserer Website bestellt werden.

Pfad: „Bestellmenü“ -> „Next Generation Sequencing“ -> „Zusätzliche Services“ -> „NGS Barcodes & UPS-Etiketten“

Nach ein paar Tagen erhalten Sie Ihre Etiketten. Bitte kleben Sie diese entsprechend der Zuordnung, die Sie im **Sample Submission Sheet** vorgenommen haben, auf Ihre Tubes. Bitte beachten Sie, dass wir nur Proben in unserem Labor akzeptieren können, die mit unseren Eurofins NGS Barcode-Etiketten gekennzeichnet sind.

Eine Liste Ihrer Eurofins NGS Barcode-Etiketten finden Sie auch unter „Konto“ -> „NGS Barcodes & Coupons“ -> „NGS Barcodes“.

Bitte beachten Sie, dass Eurofins Genomics über mehrere Standorte in Deutschland verfügt. Stellen Sie daher sicher, dass Sie Ihre Proben an den korrekten Standort senden, wie es in Ihrem Angebot oder von Ihrem Vertriebsmitarbeiter angegeben wurde.

Falls Sie UPS-Versandetiketten benötigen, können Sie diese auf unserer Website bestellen:

Pfad: „Bestellmenü“ -> „Next Generation Sequencing“ -> „Zusätzliche Services“ -> „NGS Barcodes & UPS-Etiketten“

Das UPS-Etikett wird Ihnen innerhalb eines oder zwei Tagen per E-Mail zugesendet.

Standardadresse (nicht für S2-Materialien und nicht für ONT-Lite-Service):

Eurofins Genomics Europe Pharma and Diagnostics Products & Services
Sanger/PCR GmbH
Jakob-Stadler-Platz 7
78467 Konstanz
Deutschland

Sie können den Status Ihrer Bestellung in Ihrem Ecom Account nachverfolgen.

Bitte navigieren Sie zu ihrem "Account" -> “Bestellungen” -> “Meine Bestellungen”.

Hier sehen Sie alle Ihre Bestellungen aufgelistet.

Für detailliertere Informationen zu einer Bestellung klicken Sie bitte auf das "Statusverfolgungs"-Symbol (siehe unten). Es führt Sie zu unserer Status-Seite für diese spezielle Bestellung. Hier finden Sie dann alle Details zu jeder Probe.

Melden Sie sich mit Ihrer E-Mail-Adresse und Ihrem Passwort in Ihrem Eurofins-Konto an und klicken Sie auf „Meine Bestellungen“, dann auf das Symbol neben Ihrer Bestell-ID (siehe Screenshot unten).

Die Dateien finden Sie im Abschnitt „DOKUMENTE & DATEIEN HERUNTERLADEN“.

Falls Sie komprimierte Dateien erhalten haben, empfehlen wir **7-ZIP** (https://www.7-zip.org/), um diese zu entpacken. Dateien werden 8 Wochen nach der Bereitstellung von unserem Server gelöscht.

Alternativ können Sie auf Ihre Daten über unseren FTP-Server unter **ngs-ftp.eurofinsgenomics.eu** zugreifen, indem Sie den Benutzernamen (das „ftp-“ gehört zum Benutzernamen) und das Passwort verwenden, das Sie per E-Mail erhalten, sobald Ihre ersten Daten bereitgestellt werden. Falls Sie Ihr Passwort vergessen haben, geben Sie **ngs-ftp.eurofinsgenomics.eu** in Ihren Browser ein und wählen Sie die Option „Passwort vergessen?“.

Sollten Sie auf Probleme stoßen oder Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, uns zu kontaktieren.

Wir legen großen Wert auf Datensicherheit und tun alles, um Ihre Daten privat und geschützt zu halten. Unsere Datenübertragungsmethoden sind sicher; wenn Sie jedoch eine alternative Zustellmethode bevorzugen, erfüllen wir Ihren Wunsch gerne.

Wenn Sie glauben, dass ein Verarbeitungsfehler aufgetreten sein könnte, kontaktieren Sie uns bitte, und wir werden den Fall individuell prüfen.

Dies hängt vom ausgewählten Service ab und davon, ob Sie den Service mit oder ohne bioinformatische Analyse bestellen.

Alle Details zur Bioinformatik und die Dateien, die Sie erhalten, können Sie auf der Inhaltsseite des jeweiligen Services einsehen.

Eine Übersicht über alle NGS-Services, die wir anbieten, finden Sie hier.

Allgemeine FAQs im Bereich Next Generation Sequencing >>

Die Häufigkeit von PCR-Duplikaten ist direkt mit Qualität und Menge des Ausgangsmaterials korreliert. Die Library-Erstellung mit weniger als der empfohlenen Menge an DNA erfordert zusätzliche PCR-Zyklen, damit genügend Material zum Beladen des Sequenziergeräts erzeugt wird. Die Häufigkeit von PCR-Duplikaten hängt daher von der Probe ab und kann von GATC Biotech nicht beeinflusst werden. 
Duplikate sind aus der Berechnung der durchschnittlichen zielgerichteten Abdeckung nicht ausgeschlossen. Gemäß unserer Erfahrung mit der Sequenzierung humaner Proben erzielen wir für qualitativ hochwertige DNA in der Regel PCR-Duplikatraten von ca. 5 %. 
 
Wenn weitere bioinformatische Analysen (z. B. SNP-Identifizierung) in Auftrag gegeben werden, dann wird nur eine Kopie des doppelten Read-Paares im Alignment behalten. Der Rest wird zur Vermeidung eines Bias aus der weiteren Analyse ausgenommen.

Für optimale Ergebnisse benötigen wir mindestens 100 ng aufgereinigte RNA-freie Doppelstrang-DNA mit hohem Molekulargewicht (Konzentration ≥ 1 ng/µl; OD 260/280 ≥ 1,8; OD 260/230 ≥ 2,0). Für DNA von FFPE-Proben benötigen wir mindestens 200 ng DNA. 

Eine Kontamination durch DNA von anderen Spezies (> 3 %, insbesondere von nah verwandten Spezies) könnte die Anreicherung der humanen DNA stören und reduziert zudem die Gesamtmenge an humaner DNA in der gesendeten Probe. Akzeptiert wird in der Regel amplifizierte Gesamtgenom (WGA)-DNA oder DNA aus archiviertem Gewebe, wie beispielsweise Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete (FFPE) Proben. Wenden Sie sich an uns, wenn Sie Einzelheiten wissen möchten. 

Die Fragmentierung genomischer DNA nach dem Agilent SureSelectXT-Protokoll und die darauffolgende Weiterverarbeitung ergeben eine Normalverteilung von DNA-Fragmenten mit unterschiedlichen Längen. Ein kleiner Prozentsatz der entstandenen Library-Fragmente haben eine Insert-Größe von weniger als 250 bp. Die Sequenzierung dieser Library-Fragmente mit Paired-End-Reads von 150 bp erzeugt teilweise überlappende Reads, welche die gleichen Basen abdecken; somit entsteht eine künstliche Verdoppelung der Abdeckung an diesen Stellen. Zur Gewährleistung präziser Analysen werden diese Basen aus weiteren Analysen (z. B. Erkennung von Einzelnukleotid-Varianten und Insertionen/Deletionen) ausgeschlossen. Darüber hinaus werden die Protokolle bei Eurofins Genomics fortlaufend mit dem Ziel optimiert, die Anzahl an überlappenden Basen auf ein Minimum zu reduzieren.

Bei der Sequenzierung von humanen Proben im Paired-End-Modus (150 bp) erzielt Eurofins Genomics in der Regel über 80 % Basecalls mit einem Qualitätswert von mehr als Q30 (> 99,9 % Genauigkeit). 

Für Proben, die die erste Qualitätskontrolle bei Eurofins Genomics erfolgreich bestanden haben, garantieren wir Ihnen den Ziel-Output, den Sie bestellt haben. Die durchschnittliche zielgenaue Abdeckung wird berechnet als Summe der kartierten Basen in jeder Zielposition dividiert durch die Anzahl der Basen in der Zielregion (Zielbasen / Größe der Zielregion).

Die Zielregion entspricht den Bait-Koordinaten des SureSelectHuman All Exon V6 Kits von Agilent: ca. 60 Mbp der exonischen Basen (> 93 % der Ziele werden mit > 20x, 90 % der Gene werden vollständig abgedeckt – alle Exons – 10 % der Gene werden teilweise abgedeckt).

Auf Grund der unterschiedlichen Effizienz der zur Anreicherung verwendeten Baits (z. B. GC/AT-Gehalt) werden Zielregionen unterschiedlich abgedeckt und die Reichweite und Einheitlichkeit der Abdeckung schwanken innerhalb der Zielregion. Eurofins Genomics wendet das neueste Human All Exon Kit-Design (V6) von Agilent an, das verbesserte Design-Algorithmen aufweist und somit schwierige Regionen besser erfassen und eine hervorragende Einheitlichkeit der Abdeckung bieten kann.

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Für das INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling akzeptieren wir frisches Blut (muss in BCT-Röhrchen mit einem stabilisierenden, für die cfDNA-Isolation bestimmten Puffer zur Verfügung gestellt werden) oder alternativ frische oder aufbewahrte Plasmaproben, sowie bereits isolierte zellfreie DNA. Weiteres entnehmen Sie bitte unserem Informationsblatt zur Probenvorbereitung. Die cfDNA wird aus Blutplasma extrahiert. 
Bei Ausgangsmaterial wie DNA, die aus FFPE-Proben und frisch eingefrorenen Gewebeproben isoliert wurde, sehen Sie sich bitte unser Produkt für die Charakterisierung fester Tumorproben an: INVIEW Oncoprofiling.

Die interessierenden Gene werden unter Verwendung firmeneigener Eurofins-Protokolle mit der hochmodernen Hybridisierungstechnologie SureSelect von Agilent angereichert. Das Zielregionen-Anreicherungssystem erfasst genomische Zielregionen mit Hilfe von langen 120 nt-RNA-Baits. Mit Hilfe der auf Hybridisierung basierenden Strategie können PCR-Duplikationen im Assay leicht abgezogen werden. Das Eurofins-eigene Protokoll ermöglicht die Erstellung von hochkomplexen Bibliotheken, eine tiefgreifende Abdeckung der interessierenden Regionen sowie eine verbesserte Einheitlichkeit der Sequenz. Im Anschluss an die Anreicherung der Zielregionen wird eine Next Generation Sequenzierung der Bibliothek durchgeführt.

Das Produkt sucht die Exons von etwa 728 Genomregionen ab, die an der Entstehung von Krebs beteiligt sind. Dadurch wird eine extrem hohe Anzahl von möglichen Mutationen abgedeckt und analysiert. Zu den erkannten genomischen Aberrationen zählen SNPs, InDels, und CNVs.

Die Erkennung von SNP und InDel hat eine technische Empfindlichkeit von bis zu 1 %.

Die Qualität und Quantität jeder Probe werden bei Eingang der Probe oder nach der DNA-Extraktion bestimmt. Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei verschiedenen Schritten des Prozesses.

Alle drei Tests können bei Flüssigbiopsieproben (cfDNA) zum Einsatz kommen. Die drei Produkte dienen als leistungsstarkes, nichtinvasives Tool für die Krebsprofilierung.

INVIEW Liquid Biopsy Oncoexome ist der erste kommerziell erhältliche Service für die Gesamtexom-Sequenzierung (WES) von cfDNA. Mit diesem Service erhalten Sie ein umfassendes Profil aller Mutationen in den proteinkodierenden Bereichen des Exoms. Dieses Produkt eignet sich für einen eingehenden Blick auf das Exom eines Krebspatienten in Fällen, in denen nur begrenzte Informationen über klinisch relevante Mutationen zur Verfügung stehen.

INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling ist ein umfassendes NGS-Krebspanel zur Charakterisierung wichtiger tumorspezifischer Mutationen, die bei fast allen Krebsarten eine Rolle spielen. Mittels SureSelect von Agilent und einem optimierten GATC-Protokoll zielt dieses Panel auf 600 bekannte Krebsgene einschließlich Tumorsuppressoren, Hotspots und Resistenz-Markern. Das Panel verfügt über eine optimierte Sequenzabdeckung und Gleichförmigkeit mit einer Sensitivität von 1 %.

Das Produkt steht nur für Forschungszwecke zur Verfügung. Alle Proben werden in Erfüllung der ISO 17025:2005-Akkreditierung verarbeitet.

Auch bei Einreichung von Kontrollproben (Plasmaproben von mindestens sieben andere Patienten/Personen) kann die Methode der CNV-Analyse Einschränkungen unterliegen. Sensitivität und Spezifität des Assays hängen vom Ausmaß der vorhandenen CNV sowie vom Tumoranteil ab.

Die Heterogenität eines Tumors kann eine korrekte Identifizierung aller relevanten Kopienzahlvariationen in einer gegebenen Plasmaprobe erschweren. Darüber hinaus könnte eine übermäßige Verunreinigung mit DNA aus normalen Zellen zu Unterschieden bezüglich der Abdeckung führen, die selbst bei den hochsensitiven Methoden von Eurofins Genomics zu klein sind, um nachgewiesen zu werden.

Wie empfehlen, dass die Blutprobe innerhalb von 24 Stunden nach der Entnahme an Eurofins Genomics versandt wird. Die Probe muss in Blutentnahmeröhrchen von BCT Streck gelagert werden. Lagerung und Auslieferung von Blutproben müssen bei Raumtemperatur erfolgen. Plasmaproben müssen auf Trockeneis verschickt werden.

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Für INVIEW Oncoprofiling (728 genes) akzeptieren wir frisch eingefrorene Proben sowie FFPE-Proben (Gewebe und Blut) und genomische DNA.
Für die Flüssigbiopsie-Analyse von aus Blutplasma isolierter zellfreier DNA (cfDNA) sehen Sie sich bitte unser Produkt INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling (728 genes) an.

Die interessierenden Gene werden unter Verwendung firmeneigener Eurofins-Protokolle angereichert. Die Anreicherung der Zielregionen übertrifft die Ergebnisse, die auf der üblichen PCR-basierten Anreicherung erfolgen, dank der gleichmäßigen Abdeckung aller Exone der verschiedenen Gene. Die bewährte Methode zur Anreicherung von Zielregionen wurde von Eurofins optimiert: Mit ihr können hochkomplexe Bibliotheken aus geringsten DNA- Konzentrationen entwickelt werden und sie ergibt eine tiefgreifende und einheitliche Abdeckung. Im Anschluss an die Erfassung der Zielregionen wird eine Next Generation Sequenzierung der Bibliothek durchgeführt.

Der Service deckt die gesamten Exons von etwa 600 krebsrelevanten Genomregionen vollständig ab, einschließlich proteinkodierender Gene, ausgewählter Promotorregionen, miRNAs, und extra-exonische Varianten. Neben SNPs und InDels kann das Produkt auch CNVs erkennen.

• TMB is definiert als die Anzahl der somatischen, kodierenden, Basenaustausch- und InDel-Mutationen pro Megabase des kontrollierten Genoms.
  Alle Basenaustauschmutationen und InDels in der kodierenden Region der Zielgene, inklusive der gleichbedeutenden Mutationen, werden zu Beginn gezählt. Anschließend werden wie unten beschrieben verschiedene Filter angewendet
• Die folgenden Mutationen werden bei der TMB Berechnung in silico ausgeschlossen:
  • bekannte somatische Mutationen in COSMIC und ClinVar
  • Mutationen mit geringer statistischer Sicherheit
  • Bekannte Keimbahnvarianten aus der ExAC (gnomAD) Datenbank
  • Mutationen die mittels dem Somatisch-Keimbahn-Zgyotie Algorithmus als somatisch eingestuft werden
  • Mutationen in Tumor-Suppressor Genen aufgrund der INVIEW Oncopanel All-in-One Ausrichtung auf Krebsmutationen, die Auswirkungen haben und dem möglichen Bias des Panel-Designs
• Um den TMB pro Megabase zu berechnen wird die Gesamtzahl der gefundenen Mutationen anhand der Größe kodierenden Region in der Zielregion (in Megabasen) normalisiert (Mutationen pro Megabase, mut/Mb). Aufgrund der fehlenden Standardisierung in der TMB Quantifizierung können wir 3 Werte zur Verfügung stellen
  • Nicht-gleichbedeutende Mutationen
  • Nicht-gleichbedeutende Mutationen und zusätzlich InDels
  • Inklusive aller Mutationen

Der Goldstandard für die TMB Bestimmung ist klar die "Whole-Exome" Sequenzierung (WES). Spezialisierte Panel wie das INVIEW Oncoprofiling wurde aber in aufwändigen Studien auf die Verwendbarkeit für die TMB Bestimmung untersucht, da die Sequenzierkosten deutlich güngstiger und die Sensitivität deutlich höher ist.

Neueste Ergebnisse zeigen, dass Panels mit einer Größe von > 1.5 Mbp ausreichend geeignet sind um den TMB zu Bestimmung eine eine starken Übereinstimmung zu WES (Buchhalter et al. 2019, Int J Cancer 144:848–858).

Darüber hinaus liefert das INVIEW Oncoprofiling mit seiner Größe von 3 Mbp eine viel genauere TMB Bestimmung als kleinere Panels.

Die Erkennung von SNP und InDel hat eine technische Empfindlichkeit von bis zu 1 %.

Die Qualität und Quantität jeder Probe werden bei Eingang der Probe oder nach der DNA-Extraktion bestimmt. Weitere Qualitätskontrollen erfolgen bei verschiedenen Schritten des Prozesses.

Beide Tests bieten Variantenerkennung für Krebserkrankungen auf Basis eines validierten Onkologie-Panels. Die abgesuchten Gene und Genomveränderungen des Panels sind gleich. Ebenso basieren die verwendeten Techniken bei beiden Produkten auf Hybridisierung zur Anreicherung definierter Genabschnitte sowie auf Next Generation Sequenzierung.
Der Unterschied zwischen den beiden Produkten besteht in deren Ausgangsmaterial. INVIEW Oncoprofiling (728 genes) wird auf herkömmliches Ausgangsmaterial wie z. B. frisch eingefrorene und FFPE-Gewebeproben angewandt, während mit INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling (728 genes) aus Blutplasmaproben extrahierte cfDNA analysiert wird.

Ja, die beiden Dienste eignen sich bestens für Studien, deren Ziel ein Vergleich der Leistungsfähigkeit herkömmlicher Biopsien gegenüber Flüssigbiopsien ist.

Auch bei Einreichung zusammengehöriger Proben (Tumorgewebe und Normalgewebe oder Blut vom selben Patienten) kann die gekoppelte Analysemethode Einschränkungen unterliegen. Die Varianz der Messungen an dieser einzelnen zugehörigen Referenzprobe wird höher sein als die einer Referenz, die aus mehreren Referenzproben besteht. Dies könnte zu einer geringen Anzahl von (falsch-positiven) CNV-Identifizierungen führen – auch in Fällen, in denen zwei zusammengehörige Proben tatsächlich die identische Kopienzahl haben.

Die Heterogenität eines Tumors kann eine korrekte Identifizierung aller relevanten Kopienzahlvariationen in einer gegebenen Probe erschweren. Auch wenn der Tumor selbst homogen ist, kann eine übermäßige Verunreinigung mit normalen Zellen zu Unterschieden bezüglich der Abdeckung führen, die selbst bei den hochsensitiven Methoden von Eurofins Genomics zu klein sind, um nachgewiesen zu werden.

Das Produkt steht nur für Forschungszwecke zur Verfügung. Der Service wird in einem nach ISO17025:2005 akkreditierten und nach ISO13485:2016 zertifizierten Labor durchgeführt. 

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Für INVIEW METAGENOME ADVANCE akzeptieren wir aus der klinischen Forschung stammende Proben menschlichen Ursprungs (z. B. Abstriche, Faeces, Lavage). Auf Anfrage können für die Analyse des gesamten Metagenoms viele Arten von Ausgangsmaterialien verwendet werden, wie z. B.:

Lebensmittelproben für die Qualitätskontrolle und Nachweis von Pathogenen im industriellen Umfeld (Molkereien, Brauereien, fleischverarbeitende und landwirtschaftliche Einrichtungen)
Umweltproben
Eurofins Genomics hat besonders viel Erfahrung mit der DNA-Isolierung und Sequenzierung von Stuhlproben.

Spezifische Informationen über die für spezielle Methoden der Bibliothekerstellung benötigte Menge und Konzentration finden Sie in Ihrem Angebot – oder Sie wenden sich direkt an uns. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, benötigen wir in der Regel > 100 ng aufgereinigte Doppelstrang-DNA (die Gesamtmenge hängt vom Anteil mikrobieller DNA in der Probe ab). Bitte beachten Sie, dass die DNA RNA-frei sein und eine OD 260/280 von > 1,8 und OD 260/230 von > 2,0 haben muss.

Eurofins Genomics liefert Tabellen (TSV, TXT) mit Auflistungen aller in Ihrer Probe vorhandenen Gattungen und den jeweiligen Read-Anzahlen. Zusätzlich erhalten Sie alle Rohdaten der Sequenzierung.

Operationale taxonomischen Einheiten (OTUs), klassifiziert vom Kraken‘schen exakten k-mer-Alignmentalgorithmus und der entsprechenden MiniKrakenDB-Datenbank, werden in Tabellenform mit taxonomischer Identifizierung dargestellt.

Die für die Metagenom-Sequenzierung erforderliche Sequenzierungstiefe richtet sich vor allem nach der Komplexität der Probe (der Anzahl und Repräsentation der einzelnen Spezies) sowie nach dem Grad der erwarteten Wirtskontamination. Mikrobengemeinschaften hoher Komplexität mit hohen Hintergrundwerten an Wirts-DNA erfordern mehr Abdeckung als Proben geringerer Komplexität und mit einem geringeren Grad an Wirts-DNA-Kontamination. Im Zweifelsfall empfehlen wir, die erforderliche Sequenzabdeckung anhand eines Pilotversuchs an einer Untergruppe von Proben zu bestimmen.

Ja, Inview Metagenome Advance beinhaltet eine Garantie für 10 Millionen Read-Paare. Weitere Read-Pakete können separat bestellt werden.

Die Metagenomanalyse ermöglicht die Identifizierung von Mikroorganismen unabhängig von taxonomischen Markern wie z. B. 16S rRNA. Anhand der Metagenomsequenzierung können sowohl kultivierbare als auch nicht-kultivierbare Organismen wie z. B. Bakterien, Archaeen, Pilze, Protozoen und Viren identifiziert werden. Zwar hat Eurofins Genomics am meisten Erfahrung mit der Profilierung der humanen Mikrobiota, wir charakterisieren jedoch auch mit Erfolg Elemente aus Mikrobengemeinschaften aus Lebensmittel-, Industrie und Umweltproben.

Sowohl Amplikon- als auch Metagenom-Sequenzierung weisen klare Vorteile sowie auch Nachteile auf. Ihre Methode der Wahl sollte sich nach Ihrem Forschungsziel richten. Der Erfolg eines Projekts hängt in der Regel von mehreren Faktoren ab, wie z. B. von der Zusammensetzung der Gemeinschaft, der Häufigkeit eng verwandter Arten und der Sequenzierungstiefe.

Amplikon-Sequenzierung bietet eine zweckmäßige taxonomische Profilerstellung einer großen Anzahl von Proben. Dieser Ansatz ermöglicht die Erkennung von feinen Unterschieden zwischen Mikrobengemeinschaften; daher ist die Methode für statistische Vergleiche vorteilhaft, wie z. B. für Fall-Kontroll-Studien oder für Probenahmen aus unterschiedlichen Umgebungen im Lauf der Zeit.

Metagenom-Sequenzierung ist nicht auf einen bestimmten Satz von Primern angewiesen, wodurch die Methode frei ist von taxon-spezifischem PCR-Bias. Dadurch sind präzisere Darstellungen der analysierten Mikrobiota und zuverlässigere Schätzungen von Artenhäufigkeiten möglich. Die Metagenomanalyse kann Informationen sowohl über die taxonomischen als auch die funktionellen Eigenschaften einer bestimmten Probe liefern.

Inview Metagenome Explore ist ideal geeignet für eine breit angelegte taxonomische Profilierung aller in einem bestimmten Mikrobiom vorhandenen Organismen. Die inbegriffenen 10 Millionen Read-Paare eignen sich zur Analyse von Metagenomen geringer Komplexität sowie auch für eine umfassende Übersicht über Gattungen in komplexen Metagenomen. Eine tiefere Sequenzabdeckung kann anhand von zusätzlichen Read-Paketen erreicht werden.

Inview Metagenome Advance bietet zusätzlich zur taxonomischen Charakterisierung eine detaillierte Beurteilung von Antibiotikaresistenzen und der Funktion in der Gemeinschaft. Das Produkt ist ideal für die Profilerstellung komplexer Metagenome. Für eine tiefere Sequenzabdeckung als die inbegriffenen 10 Millionen Read-Paare können zusätzliche Read-Pakete hinzugefügt werden. Der Service kann auf die Quantifizierung funktioneller Prozesse in einer speziellen Gemeinschaft oder auf die Erkennung zahlreicher Resistenzfaktoren in einer ungestörten natürlichen Umgebung angewendet werden. Bitte beachten Sie, dass die erforderliche Sequenziertiefe für eine erfolgreiche Metagenomprofilierung stark von der Komplexität und dem erwarteten Grad an Wirtskontamination des Ausgangsmaterials beeinflusst wird. Daher ist möglicherweise ein zusätzlicher Sequenzier-Aufwand erforderlich, um zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen.

Allgemeine FAQs im Bereich Next Generation Sequencing >>

Dies hängt von vielen Faktoren ab, wie u. a. von der Art der Gewebes, der Probenqualität, dem Entwicklungsstadium, den vorhandenen Sequenzen usw.. Entnehmen Sie bitte der Tabelle unter „Produktspezifikationen“ Ihre optimale INVIEW Transcriptome-Lösung. Die dort angegebenen geschätzten Read-Anzahlen beziehen sich auf humane Proben. Alternativ können Sie uns kontaktieren, um Ihr Projekt mit uns zu besprechen. In bestimmten Fällen ist es möglicherweise ratsam, mit Hilfe eines Testlaufs zu ermitteln, wie viele Reads für Ihren speziellen Zweck oder Organismus benötigt werden.

Das INVIEW Transcriptome Discover verwendet eine strangspezifische RNA-Library kombiniert mit 150 bp Paired-End-Sequenzierung von Illumina. Somit empfiehlt sich das Paket für die Erkennung von differenziell exprimierten Genen, seltenen und neuen Transkripten sowie für die Entdeckung von Spleißvarianten. Darüber hinaus ermöglichen die Informationen über die Orientierung des Transkripts eine präzisere Bestimmung von Struktur und Genexpression.

Das INVIEW Transcriptome Bacteria beinhaltet 10 Millionen Reads / Read Paare und ist somit günstiger als das INVIEW Transcriptome Explore / Discover. 10 Millionen Reads / Read Paare sind aber für die meisten Untersuchungen bakterieller RNA völlig ausreichend.

Das INVIEW Transcriptome Ultra Low ist speziell für Projekte mit nur sehr sehr wenig Ausgangsmaterial entwickelt.

INVIEW Transcriptome Discover:

Nicht unbedingt. Sollten Sie jedoch eine Referenz haben, nehmen Sie bitte die folgenden Empfehlungen unten zur Kenntnis.

INVIEW Transcriptome Bacteria / Ultra Low:

Ein klar definierter Ensembl-Name (z. B. GRCh37 oder Rnor_5.0) für die annotierte genomische Referenzsequenz muss vor Projektbeginn zur Verfügung gestellt werden. Alternativ kann die Genomsequenz in Fasta bereitgestellt werden (zusammen mit der entsprechenden Annotation im Gene Transfer Format (GTF) oder im GenBank-Format, einschließlich Annotation).

Zur Erstellung von Libraries für die Sequenzierung kann Gesamt-RNA aus Gewebe, Zellen oder Körperflüssigkeiten von eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen verwendet werden. Zusätzlich zu aus frischem Gewebe isolierter RNA kann auch RNA aus FFPE-Proben analysiert werden. RNA-Isolation kann als Zusatzleistung angeboten werden. Bei Fragen zu Ausgangsmaterial aus anderen Quellen sprechen Sie uns bitte an.

Für das INVIEW Transcriptome Ultra Low können wir keine Zellen in Zellkultur annehmen. Desweiteren können wir hier nicht garantieren, das genug RNA extrahiert werden kann.

Informationen über die für spezielle Methoden der Library-Erstellung benötigte RNA-Menge und -Konzentration finden Sie in Ihrem Angebot – oder Sie wenden sich an uns. In der Regel benötigen wir für optimale Ergebnisse 150 ng hochwertige RNA (bis zu 15 μl / optimale Konzentration 6 - 50 ng / μl (maximale Konzentration 200 ng / μl) mit einer OD 260/280 von 1,8 – 2,0 und einer OD 260/230 von 2,0 – 2,2. Möglicherweise kann mit weniger Material begonnen werden, doch dies hängt in hohem Maß von der Qualität des Materials und der gewünschten Library ab.
Die Qualität und Quantität des bereitgestellten Ausgangsmaterials sind für den Erfolg der Probenvorbereitung entscheidend. Bei Verwendung von zu wenig oder degradiertem, kontaminiertem oder anderweitig geschädigtem Ausgangsmaterial kann die Folge ein sehr niedriger Ertrag, eine fehlgeschlagene Probenvorbereitung sowie eine beeinträchtigte Qualität und Quantität der Sequenzierungsergebnisse sein.

Für das INVIEW Transcriptome Ultra Low:

Mindestens 0.15 ng/µl (in min. 10 µl). RIN > 6.5

Eurofins Genomics bietet RNA-Isolation als Zusatzleistung an. Wir haben die Protokolle zur Extraktion von qualitativ hochwertiger RNA aus mehreren Probenarten und Ausgangsmaterialien erfolgreich optimiert. Weitere Informationen zur RNA-Isolation finden Sie in den Produktspezifikationen – oder lassen Sie sich von uns direkt beraten: Wir besprechen mit Ihnen mögliche Methoden der Probenvorbereitung für Ihre individuellen Anforderungen.

a) Für Eukaryoten: Eine rRNA-Abreicherung empfiehlt sich für teilweise degradierte RNA oder bei Sequenzierung der RNA ohne Poly-A-Schwanz.

b) Für Prokaryoten empfehlen wir generell eine rRNA-Abreicherung, da eine poly-(A)-Anreicherung von prokaryotischen Transkripten nicht durchführbar ist.

Eine rRNA-Abreicherung kann bei Eurofins Genomics angefordert werden. Alternativ können Sie uns eine bereits rRNA-abgereicherte/mRNA-angereicherte RNA als Ausgangsmaterial zur Verfügung stellen (20 ng pro Probe (bis zu 15 µl / Konzentration >1,4 ng/µl)). Weitere Informationen finden Sie in den Produktspezifikationen

Die Effizienz der RNA-Entfernung richtet sich nach dem Organismus, der Zusammensetzung und der Qualität Ihrer Proben-RNA. Bei stark degradierter RNA kann eine Ribo-Abreicherung weniger effizient sein.

RNA muss auf Trockeneis versandt werden, sofern sie nicht mit Ethanol ausgefällt wurde. Gewebe/Zellkulturen müssen in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis schockgefroren und auf Trockeneis versandt werden. Alternativ kann frisches Material in „RNAlater“ (z. B. von Ambion, SIGMA oder QIAGEN) stabilisiert und bei Raumtemperatur versandt werden. Bitte prüfen Sie im Voraus, ob der von Ihnen beauftragte Kurier Trockeneisversand anbietet.

Da ribosomale RNA (rRNA) den Großteil einer Gesamt-RNA-Probe ausmacht, empfehlen wir, sie zu entfernen, um die Probe für andere RNA-Typen anzureichern. Dies kann entweder durch eine Poly-A-Selektion oder eine rRNA-Depletion erreicht werden, beide Methoden helfen, die Analyse auf informativere RNA-Populationen zu konzentrieren.

RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Transkriptomanalyse, und die Wahl zwischen PolyA-Anreicherung und rRNA-Depletion hängt von den spezifischen Zielen des Experiments und den Arten von RNA ab, die Sie untersuchen möchten. Hier ist eine Übersicht, wann jede Methode sinnvoll ist:

1. PolyA-Anreicherung

PolyA-Anreicherung isoliert selektiv mRNA, indem sie an die PolyA-Schwänze bindet, die am 3'-Ende der meisten eukaryotischen mRNAs zu finden sind. Dies ist nützlich, wenn Sie hauptsächlich an kodierender RNA (mRNA) interessiert sind, und vereinfacht die Analyse, indem die Komplexität der Probe reduziert wird.

Wann sollte man PolyA-Anreicherung verwenden?

• Fokus auf mRNA: Wenn Ihr Ziel darin besteht, protein-kodierende Gene zu analysieren, ist die PolyA-Anreicherung ideal, da sie die meisten mRNAs mit einem PolyA-Schwanz erfasst (was den Großteil des Transkriptoms in eukaryotischen Zellen ausmacht).
• Eukaryotische Proben: Die meisten eukaryotischen mRNAs haben PolyA-Schwänze, was die PolyA-Anreicherung besonders nützlich für diese Spezies macht.
• Reduzierung der rRNA-Interferenz: In RNA-Proben mit hohem rRNA-Gehalt hilft die PolyA-Anreicherung, die rRNA-Kontamination zu reduzieren, indem sie selektiv mRNA anreichert, obwohl sie rRNA nicht vollständig entfernt.
• mRNA-Profilierung: Wenn Sie Transkriptomik durchführen, um Genexpressionsniveaus oder alternatives Spleißen in kodierenden Regionen zu verstehen, ist die PolyA-Anreicherung effektiv.

Einschränkungen:

• Nicht-polyadenylierte RNAs: Sie erfasst keine nicht-polyadenylierten RNA, wie lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs), miRNAs, rRNAs und einige kleine RNAs.

Überlegungen für minderwertige RNA (PolyA-Anreicherung):

• Reduzierte mRNA-Erfassung: Wenn die mRNA fragmentiert oder degradiert ist, erfasst die PolyA-Anreicherung hauptsächlich das 3'-Ende der mRNA, und es könnte zu einem Verlust wichtiger Daten kommen. Dies ist oft der Fall bei RNA, die aus FFPE-Schnitten extrahiert wurde.
• Moderate Degradation: Die PolyA-Anreicherung kann immer noch nützlich sein, wenn die RNA-Degradation moderat ist (d.h. nicht stark fragmentiert), solange eine ausreichende Menge intakter polyadenylierter RNA vorhanden ist.

2. rRNA-Depletion

Die rRNA-Depletion entfernt den Großteil der ribosomalen RNA (rRNA), die 80-90% der Gesamt-RNA in den meisten eukaryotischen Zellen ausmacht. Durch die Depletion der rRNA können Sie andere RNA-Typen analysieren, die weniger häufig vorkommen, wie mRNA (in Fällen, in denen die PolyA-Anreicherung nicht bevorzugt wird), lncRNAs, kleine RNAs und andere nicht-kodierende RNAs.

Wann sollte man rRNA-Depletion verwenden?

• Umfassende Transkriptomanalyse: Wenn Ihr Ziel darin besteht, alle Arten von RNA zu untersuchen, einschließlich nicht-kodierender RNAs (wie lncRNAs und miRNAs), kleiner RNAs oder sogar nicht-polyadenylierter mRNAs, ist die rRNA-Depletion eine bessere Option, da sie diese RNA-Typen bewahrt.
• Prokaryotische Proben: In Prokaryoten (die rRNA als die häufigste RNA haben) wird die rRNA-Depletion häufig verwendet, um die Qualität der RNA-Seq-Daten zu verbessern, da prokaryotische mRNAs keine PolyA-Schwänze haben.

Einschränkungen:

• Teilweise rRNA-Entfernung: In einigen Fällen entfernen rRNA-Depletionsmethoden möglicherweise nicht alle rRNA-Spezies, sodass einige Restmengen verbleiben.

Überlegungen für minderwertige RNA (rRNA-Depletion)

• Schwere RNA-Degradation: Die rRNA-Depletion eignet sich besser für minderwertige oder degradierte RNA, z.B. RNA, die aus FFPE-Schnitten extrahiert wurde, da sie nicht auf die Integrität der PolyA-Schwänze angewiesen ist. Auch bei fragmentierter RNA kann die rRNA-Depletion die rRNA-Kontamination effektiv reduzieren.

Zusammenfassung:

• PolyA-Anreicherung ist optimal, wenn Sie sich auf mRNA konzentrieren und die RNA-Qualität hoch bis moderat ist. Sie ist weniger effektiv, wenn die RNA degradiert ist oder wenn Sie nicht-polyadenylierte RNAs analysieren müssen.
• rRNA-Depletion funktioniert gut für alle nicht-rRNA-Typen und prokaryotische mRNA, insbesondere wenn Sie ein breiteres Spektrum von RNA erfassen möchten, einschließlich nicht-polyadenylierter RNAs wie lncRNAs. Diese Methode ist auch ideal, wenn Sie mit stark degradierter RNA arbeiten.

Wir bieten rRNA-Depletion unter Verwendung spezialisierter Kits für eine Vielzahl von Organismen an, einschließlich Mensch, Maus, Ratte, Bakterien und Pflanzen. Diese Kits sind darauf ausgelegt, ribosomale RNA effizient zu entfernen, wodurch eine fokussiertere Analyse des Transkriptoms in diesen Spezies ermöglicht wird.

Unser rRNA-Depletionsservice ist mit einer Vielzahl von Säugetierarten kompatibel, obwohl die Depletionseffizienz je nach Art variieren kann. Hier ist eine Zusammenfassung der rRNA-Depletionseffizienzen für mehrere Arten basierend auf Schätzungen:

• Huhn: 82%
• Kuh: 98%
• Javaneraffe (Macaca fascicularis): 88%
• Hund: 90%
• Hamster: 95%
• Pferd: 98%
• Schwein: 80%
• Kaninchen: 81%
• Schaf: 95%

Unser rRNA-Depletionsservice ist mit einer Vielzahl von Pflanzenarten kompatibel, obwohl die Depletionseffizienz je nach Art variieren kann. Hier ist eine Zusammenfassung der rRNA-Depletionseffizienzen für mehrere Arten basierend auf Schätzungen:

• Arabidopsis: 99%
• Gerste: 92%
• Mais: 90%
• Baumwolle: 99%
• Leinsamen: 87%
• Ahorn: 89%
• Hafer: 99%
• Kartoffel: 93%
• Reis: 91%
• Roggen: 99%
• Sorghum: 79%
• Sojabohne: 93%
• Weizen: 94%

Zur Analyse von RNA aus Blutproben empfehlen wir sowohl die rRNA-Depletion als auch die Globin-mRNA-Depletion. Da Globin-mRNA einen erheblichen Anteil der RNA im Blut ausmacht, hilft deren Depletion zusammen mit der rRNA-Depletion, die Probe für andere weniger häufige, aber biologisch relevante RNA-Spezies anzureichern.

Für Ultra-Low Input RNA-Seq verwenden wir die Poly-A-Selektion, um mRNA anzureichern, da sie sehr effektiv darin ist, das Transkriptom aus kleinen RNA-Mengen zu erfassen. Bitte beachten Sie, dass für diesen Service aufgrund der begrenzten Menge an Eingangs-RNA keine rRNA-Depletion verfügbar ist.

Daher ist Ultra-Low Input RNA-Seq nur für eukaryotische RNA verfügbar.

Die erforderliche Anzahl an Reads hängt von Faktoren wie der Größe des Genoms, der Anzahl der bekannten Gene und Transkripte ab. Als allgemeine Richtlinie empfehlen wir:

• 5-10 Millionen Read-Paare pro Probe für kleine Genome (z.B. Bakterien)
• 20-30 Millionen Reads pro Probe für größere Genome (z.B. Mensch, Maus)
• Für mittelgroße Genome (z.B. Hefe) kann die erforderliche Anzahl an Reads je nach Projekt variieren, aber typischerweise schlagen wir 15-20 Millionen Reads pro Probe vor.
• Für de novo Transkriptom-Assemblierungsprojekte empfehlen wir etwa 100 Millionen Reads pro Probe.

Wir stellen Rohdaten als FASTQ-Dateien für alle Projekte zur Verfügung. Darüber hinaus bieten wir fortgeschrittene bioinformatische Dienstleistungen an, die optional zur Datenanalyse genutzt werden können. Die verfügbaren bioinformatischen Dienstleistungen für RNA-Seq-Projekte sind wie folgt:

Standardanalyse:

• Qualitätsbewertung der Sequenzierungsdaten
• Ausrichtung der Reads auf ein Referenzgenom
• Assemblierung und Quantifizierung von Transkripten
• Normalisierung der Genanzahl
• Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Genen
• Hauptkomponentenanalyse (PCA)
• Signifikanztests
• Erstellung detaillierter Berichte und Visualisierungen

Optionale Analyse:

• Analyse des alternativen Spleißens (AS)
• Genfusion-Analyse
• Varianten-Erkennung und deren Auswirkungen auf Proteinveränderungen

Erweiterte Analyse:

• Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA)

Jeder Service umfasst spezifische Ergebnisse und hat damit verbundene Kosten und Bearbeitungszeiten.

Wenn die Gesamt-RNA sequenziert wird, dann erhalten sie eine Vielzahl von RNA-Typen, einschließlich:

• mRNA: Liefert Informationen zur Genexpression.
• rRNA: Dominiert die meisten RNA-Proben, es sei denn, sie wird depletiert.
• tRNA und nicht-kodierende RNAs: Kleinere Mengen, aber sie spielen wichtige regulatorische Rollen.

Ohne spezifische Anreicherung wird rRNA wahrscheinlich die Daten dominieren.

Während des RNA-Seq – Ultra Low Bibliotheksvorbereitungsprozesses werden Primer- und Adaptersequenzen während der cDNA-Synthese und -Amplifikation zur RNA hinzugefügt. Diese Sequenzen sind für den Sequenzierungsprozess notwendig, gehören jedoch nicht zum eigentlichen biologischen Transkript. Wenn sie in den Daten verbleiben, können sie Rauschen verursachen und die Qualität der Sequenzierungsergebnisse verringern. Um hochwertige Daten zu gewährleisten, trimmt Eurofins diese Sequenzen vor der Lieferung, was zu leicht verkürzten Sequenzierungsreads führen kann.

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Wir empfehlen, Ihre Amplicons mit kommerziell erhältlichen Kits auf Basis von DNA-bindenden Beads oder Säulen oder durch enzymatische Reinigung aufzubereiten. Schicken Sie KEINE Primer mit Ihren Proben oder in Ihre Proben gemischt.

Reichen Sie gereinigte PCR-Produkte mit einer Größen von 150–270 bp (NovaSeq) oder 280–570 bp (MiSeq) ein. Die Amplicons sollten idealerweise ein einzelnes Band auf einem Gel erzeugen, um optimale Ergebnisse zu gewährleisten.

Nein, es werden ausschließlich Amplikons innerhalb unserer Größenbereiche 150–270 bp für NovaSeq oder 280–570 bp für MiSeq) akzeptiert. Für größere Produkte empfehlen wir unsere ONT-Amplicon-Sequenzierungsdienste. Wenn Sie sich bei der Produktauswahl unsicher sind, wenden Sie sich bitte an Ihren Vertriebsmitarbeiter.

Für 150–270 bp lange Amplicons, die auf unserer NovaSeq sequenziert werden, nutzen Sie bitte unser **Inline Tag Design Tool**: NGS Adapter Ligation Oligos (eurofinsgenomics.eu). Wählen Sie beim Bestellen den optionalen Service „Tag sorting – Eurofins Genomics Design“. Sie erhalten sortierte Sequenzen (FASTQ).

• **192 individuelle Inline-Tags** stehen zur Verfügung, jeweils bestehend aus 10 Nukleotiden, die dem Forward-Primer hinzugefügt werden.
• Es gibt einen minimalen Editierabstand von 4, um Fehlzuweisungen durch Sequenzierfehler zu vermeiden.
• Die Tags sind für sowohl kleine als auch große Probenpools optimiert.
• Alle "NGS-grade-Oligos" durchlaufen spezifische Prozesse, um eine kontaminationsfreie und hochreine Performance sicherzustellen.
• Für das Multiplexing von 24 Proben mit der gleichen Zielsequenz werden 24 Forward-Primer (jeder mit einem einzigartigen Inline-Tag) und ein Reverse-Primer (ohne Tags) benötigt.

Normalerweise würden Sie pro Probe 1 Amplikon senden, das mit 1 Primerpaar erzeugt wurde.

In einigen Fällen können jedoch weniger Reads pro Amplikon erforderlich sein, wie in der Projektspezifikation angegeben. In solchen Fällen können die einzelnen Amplikonproben, die Sie senden, auch aus mehreren Amplikons bestehen, die mit verschiedenen Primerpaaren generiert wurden. In diesem Fall werden wir jedoch keine Primersequenzen clippen.

Amplikons auf NovaSeq:

Schicken Sie mindestens 25 µL gereinigte PCR-Produkte mit einer Größe von 150–270 bp, mit einer Konzentration von > 4 ng/µL und einer Reinheit (A260/280) von 1,8–2,0. Die Amplikons dürfen keine TruSeq-Adaptersequenz enthalten.

Amplikons auf MiSeq:

Reichen Sie mindestens 25 µL gereinigte PCR-Produkte mit einer Größe von 300–570 bp ein, mit einer Konzentration von > 1 ng/µL und einer Reinheit (A260/280) von 1,8–2,0. Die Amplicons müssen TruSeq-Adaptersequenzen enthalten.

Die Proben können in RNase-, DNase- und proteasefreiem Wasser, EB- oder niedrigem TE-Puffer vorliegen.

Bitte beachten Sie auch auch die Probenvorbereitungsinformationen in den allgemeinen FAQs, um weitere Informationen zu organisatorischen Themen und zur Vorbereitung Ihrer Proben vor dem Versand an unsere Standorte zu erhalten.

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Die tatsächliche erzielte Sequenzierungsleistung (Read-Länge, Read-Qualität und Anzahl der Reads) korreliert direkt mit der Qualität der verwendeten Sequenzierungsbibliothek. GATC Biotech kann keine Garantien für Sequenzierungsdaten aus kundenseitig erstellten Ready-to-Load-Bibliotheken geben. Sollte es aufgrund von technischen Problemen mit den Sequenzierungskits oder -geräten zu unbefriedigenden Sequenzierungsergebnissen kommen, wird die Sequenzierung ohne zusätzliche Kosten für den Kunden wiederholt.

Das Sortieren von Rohdaten gemäß Illumina Index Read ist inbegriffen. Der verwendete Index-Typ (Single Index oder Dual Index) sowie die entsprechenden Index-Sequenzen müssen vor dem Projektbeginn zur Verfügung gestellt werden.
Die Sortierung der Rohdaten nach kundenspezifischen Markierungen (Tags) zu Beginn des Reads kann gegen Aufpreis angeboten werden. Wir empfehlen dringend, die „lineare“ Barcode-Strategie zu vermeiden und stattdessen das Indexsystem von Illumina zu verwenden (d. h. die Barcodes werden in einem separaten Read gelesen und die Registrierung von Clustern wird nicht beeinträchtigt). Es ist unbedingt auf eine ausgewogene Basenzusammensetzung der Indizes zu achten, damit die Bildanalyse-Software die einzelnen Signale optimal unterscheiden kann.

Die Cluster-Erkennungsalgorithmen von Illumina sind so optimiert, dass die A-, T-, G- und C-Nukleotide gleichmäßig repräsentiert sind. Jede Abweichung von einer gleichmäßigen Verteilung der Basen wirkt sich negativ auf die Menge und die Qualität der erzeugten Sequenzierungsdaten aus. Bei Proben mit geringer Vielfalt oder unausgewogener Basenzusammensetzung (z. B. Amplikons, bisulfitkonvertierte Proben) wird zur Verbesserung des Nukleotid-Gleichgewichts der Bibliothek ein PhiX-„Spike-in“ (20%) eingesetzt. Das Ausmaß, in dem die negativen Auswirkungen der unausgewogenen Basenzusammensetzung durch das „Spike-in“ der PhiX-Kontrolle reduziert werden, ist von der einzelnen Probe und den Sequenzeigenschaften abhängig. Weitere Informationen entnehmen Sie bitte der Illumina-Website.

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Für das INVIEW Liquid Biopsy Oncoexome akzeptieren wir frische oder aufbewahrte Plasmaproben, sowie bereits isolierte zellfreie DNA. Weiteres entnehmen Sie bitte unserem Informationsblatt zur Probenvorbereitung für Liquid Biopsy Produkte (siehe "Dateien"). Die ctDNA wird aus Blutplasma extrahiert.
Für Ausgangsmaterial wie z. B. aus FFPE und Gewebeproben isolierte DNA sehen Sie sich bitte unser Produkt INVIEW Human Exome an.

In der Regel benötigen wir entweder 4 ml Plasma oder 15 ng bereits isolierte zellfreie DNA(bis zu 30 µl /Konzentration > 0,5 ng/µl). 

Das Produkt INVIEW Liquid Biopsy Oncoexome umfasst mehrere Leistungen im Vorfeld der Sequenzierung, z. B. ctDNA-Extraktion aus Plasma und Bibliothekerstellung mit hoher Komplexität und niedriger Duplikatrate. Die gezielte Suche von Exons erfolgt mit SureSelect von Agilent, das eine überdurchschnittliche Exon-Anreicherung und gleichförmige Abdeckung bietet.

Die erforderliche Abdeckung ist von der erforderlichen Empfindlichkeit der Variantenerkennung abhängig. Sie können die Sequenzabdeckung wählen, die Sie für Ihr individuelles Projekt und Studienziel benötigen.
Basierend auf Erfahrungen aus der Analyse zellfreier DNA von mehr als 40.000 Proben bis zum heutigen Tag empfehlen wir generell eine Abdeckung von 100x.

Alle drei Tests beruhen auf Flüssigbiopsie. Bei allen drei Produkten handelt es sich um leistungsstarke, nichtinvasive Hilfsmittel zur Charakterisierung von Tumoren in Echtzeit. Mit ihrer Hilfe kann die gesamte Heterogenität der Erkrankung erfasst werden.

INVIEW Liquid Biopsy Oncoexome ist der erste kommerziell erhältliche Service für die Gesamtexom-Sequenzierung (WES) von ctDNA. Mit diesem Service erhalten Sie ein umfassendes Profil aller Mutationen in den proteinkodierenden Bereichen des Genoms. Dieses Produkt eignet sich für einen ersten Blick auf das Genom eines mutmaßlichen Krebspatienten in Fällen, in denen nur begrenzte Informationen über klinisch relevante Mutationen zur Verfügung stehen.

INVIEW Liquid Biopsy Oncoprofiling (591 genes) ist ein umfassendes NGS-Panel zur Charakterisierung wichtiger Krebsmutationen. Mittels Einzelmolekül-PCR zielt dieses Panel auf 50 bekannte Krebsgene einschließlich Tumorsuppressoren, Hotspots und Resistenz-Markern. Hinsichtlich der Sequenzabdeckung und Gleichförmigkeit mit einer Sensitivität von ca. 1 % setzt das Panel einen neuen Standard in der Branche.

INVIEW Liquid Biopsy Oncotarget ermöglicht den ultrasensitiven Nachweis von klinisch relevanten krebsspezifischen Punktmutationen, Insertionen, Deletionen und Genfusionen in zirkulierender Tumor-DNA bis zu einer Allelfrequenz von 0,1 %. Diese Methode eignet sich für die Therapieüberwachung, da sie empfindlich genug ist, um ein Rezidiv in sehr frühem Stadium zu erkennen.

Blutproben müssen innerhalb von 24 Stunden nach der Blutentnahme an Eurofins Genomics versandt werden. Die Probe muss in Blutentnahmeröhrchen von BCT Streck gelagert werden. Die Proben können bei Raumtemperatur gelagert und geliefert werden. Plasmaproben müssen auf Trockeneis verschickt werden.

Eurofins Genomics nimmt eine beliebige Anzahl von Proben in Vielfachen von vier an.

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Es können alle Bakterien, Archaeen und Pilze identifiziert werden, zu denen eine Sequenz in der NCBI Nukleotid Datenbank publiziert ist. Es gibt momentan zum Beispiel tausende bakterielle Spezies mit Sequenz-Einträgen in der Nukleotid Datenbank. Nah verwandte Arten mit fast identischen DNA-Sequenzen können nicht unterschieden werden. In diesen Fällen wird nur der Genus (oder die Familie) bestimmt.

Mikrobiom-Profiling durch Next-Generation-Sequencing (NGS) ermöglicht die Detektion einer Vielzahl von Spezies, darunter:

• Bakterien: Alle bakteriellen Spezies mit veröffentlichten Sequenzen in der NCBI-Nukleotiddatenbank können identifiziert werden.
• Archaeen: Archaeenspezies, die in der NCBI-Datenbank vertreten sind, können ebenfalls detektiert werden.
• Pilze: Pilzarten können durch die Analyse der Internal Transcribed Spacer (ITS)-Regionen oder der 18S-Region identifiziert werden, sofern ihre Sequenzen in der NCBI-Datenbank verfügbar sind.
• Cyanobakterien: Derzeit ist die Identifizierung von Cyanobakterien aufgrund der Einschränkungen des bestehenden Primer-Setups nicht möglich. Falls Cyanobakterien ein zentraler Fokus Ihrer Studie sind, empfehlen wir die Verwendung alternativer Primer-Sets oder spezifisch entwickelter Methoden zur Amplifikation und Detektion.

Wichtige Hinweise:

• Auflösungsgrenzen: Nah verwandte Spezies mit nahezu identischen DNA-Sequenzen können möglicherweise nicht unterschieden werden. Die Ergebnisse beziehen sich typischerweise nur auf die Gattung- oder Familienebene.
• Probenqualität: Die Qualität der DNA und die spezifischen Zielregionen können die Detektionsmöglichkeiten beeinflussen.
• Datenbankabdeckung: Die Identifizierung von Spezies hängt von der Vollständigkeit und Genauigkeit der Referenzsequenzen in der NCBI-Datenbank ab.

Falsch-Negative Ergebnisse:

• Degradierte DNA: Proben mit stark degradierter DNA können dazu führen, dass keine Spezies identifiziert wird, was zu falsch-negativen Ergebnissen führt.
• Geringe Abundanz: Spezies, die in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden sind (typischerweise unter 0,5 % aller zugeordneten Reads), können möglicherweise nicht erkannt oder gemeldet werden, selbst wenn sie in der Probe vorhanden sind.

Falsch-Positive Ergebnisse:

• Hohe Sensitivität: NGS detektiert alle erfolgreich amplifizierten DNA-Amplicons. Sequenzen mit niedriger Abundanz oder unerwarteter Länge können aufgrund von PCR- oder Sequenzierungsfehlern fälschlicherweise identifiziert werden.
• Filterungsprozess: Um falsch-positive Ergebnisse zu minimieren, werden während der Datenanalyse strenge bioinformatische Filter angewendet.

Negative Kontrollen:

Um falsch-positive Ergebnisse weiter zu reduzieren, wird eine negative Kontrolle (steriles Wasser) parallel zu den Proben analysiert.

Ja, 16S-Primer können manchmal pflanzliche Organellen amplifizieren, insbesondere das 16S-rRNA-Gen, das in den Chloroplasten von Pflanzen vorkommt. Chloroplasten enthalten eigene ribosomale RNA-Gene, die aufgrund ihres evolutionären Ursprungs Bakterien ähneln.

Der Grad der Amplifikation hängt jedoch von mehreren Faktoren ab:

Primerspezifität:
Einige 16S-Primer sind speziell für bakterielle Ziele entwickelt und amplifizieren möglicherweise Chloroplasten-DNA nicht effizient. Andere könnten breiter anwendbar sein und auch Chloroplasten-DNA einschließen.

Probenzusammensetzung:
In Proben mit einer komplexen Mischung von Organismen, wie z. B. Umweltproben, kann das Vorhandensein von Pflanzen-DNA zur Amplifikation von Chloroplasten-Sequenzen führen.

Zielregion:
Verschiedene Regionen des 16S-Gens weisen unterschiedliche Konservierungsgrade zwischen bakterieller und Chloroplasten-DNA auf, was die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Amplifikation beeinflussen kann.

Empfehlung:
Wenn Sie ausschließlich bakterielle Gemeinschaften analysieren möchten und die Amplifikation pflanzlicher Organellen vermeiden wollen, sollten Sie Primer auswählen, die speziell für bakterielle 16S-rRNA-Gene entwickelt wurden.

Richtlinien zur Auswahl von Zielregionen und Anzahl der Targets für 16S-Mikrobiomanalysen:

Auswahl der Zielregionen:
Für eine umfassende mikrobielle Profilierung wählen Sie mindestens eine Zielregion des 16S-rRNA-Gens. Häufig analysierte Regionen sind V1-V3, V3-V4 oder V3-V5. Die Wahl hängt von Ihren Forschungszielen und den spezifischen interessierenden Taxa ab.

Berücksichtigung mehrerer Zielregionen:
Um die Abdeckung zu maximieren und die Vielfalt Ihrer mikrobiellen Gemeinschaft besser zu erfassen, ist es vorteilhaft, mehrere 16S-Zielregionen zu analysieren. Dies kann helfen, die Einschränkungen einzelner Primer-Sets zu kompensieren, da manche Arten möglicherweise nicht effizient amplifiziert werden.

Literaturrecherche:
Prüfen Sie vorhandene Studien und Literatur zu den von Ihnen gewählten Zielregionen. Dies gibt Einblicke in potenzielle Verzerrungen oder Einschränkungen der verschiedenen Primer-Sets und unterstützt Ihre Auswahl.

Probentyp:
Berücksichtigen Sie die Art Ihrer Proben (z. B. Umwelt-, klinische Proben) und deren erwartete Diversität. Komplexere Proben erfordern möglicherweise eine breitere Auswahl an Zielregionen, um die Gemeinschaftsstruktur präzise widerzuspiegeln.

Experimentelles Design:
Wenn Ihre Analyse darauf abzielt, verschiedene Proben oder Bedingungen zu vergleichen, stellen Sie sicher, dass in allen Proben dieselben Zielregionen verwendet werden. Dies gewährleistet Konsistenz bei der Dateninterpretation.

Qualitätskontrolle bei der Amplicon-Generierung und Sequenzierung

• Amplicon-Generierung als primäre Eingangskontrolle: Obwohl unsere PCR-Bedingungen optimiert sind, hängt der Erfolg der Amplicon-Generierung stark von der Menge an bakterieller, archaeeller oder pilzlicher DNA in der Probe ab.
• Qualität der DNA-Extraktion: Wenn wir die DNA extrahieren, wird die Menge der extrahierten DNA mittels Spektrophotometrie bewertet.

Erste Bewertung: Falls kein Amplicon generiert werden kann oder das generierte Amplicon sehr schwach ist, deutet dies stark darauf hin, dass der DNA-Gehalt möglicherweise unzureichend ist.

Negative Kontrollen:

Jede Charge enthält negative Kontrollen (steriles Wasser), um potenzielle Kontaminationen während der Probenvorbereitung zu erkennen.

Qualitätsbewertung der Sequenzierung:

• Überwachung der Lesequalität: Nach der Sequenzierung wird die Qualität der Reads anhand von Metriken wie Q-Scores bewertet, um potenzielle Probleme mit der Sequenziergenauigkeit zu identifizieren.
• Filterung von niedrigqualitativen Reads: Niedrigqualitative Reads und Adapter-Sequenzen werden während der bioinformatischen Analyse entfernt, um die Datenqualität zu verbessern.

Keine Amplicon-Generierung:

Wenn kein Amplicon generiert werden kann, informieren wir Sie und stoppen die Verarbeitung dieser Proben. Für den nicht durchgeführten Sequenzierungsteil wird Ihnen eine Erstattung gewährt.

Schwache Amplicon-Generierung:

Falls nur ein schwaches Amplicon generiert wird, informieren wir Sie ebenfalls. Auf Kundenwunsch kann Eurofins Genomics diese Amplicons dennoch in den Sequenzierungspool aufnehmen. Erfahrungsgemäß resultieren schwache Amplicons jedoch typischerweise in einer sehr geringen Anzahl von Reads. Die Interpretation dieser Reads sollte daher mit Vorsicht erfolgen.

Genetische Variation:
Verschiedene Spezies weisen unterschiedliche Längen der Zielregionen in ihren Genomen auf. Beispielsweise kann das 16S-rRNA-Gen zwischen bakteriellen Spezies erheblich variieren, was zu Unterschieden in den Amplicon-Längen während der Amplifikation führt.

Intraspezifische Diversität:
Selbst innerhalb einer einzigen Spezies können genetische Variationen, wie Polymorphismen oder Mutationen, Unterschiede in den Amplicon-Längen verursachen.

Ja, insbesondere bei menschlichen Proben. Stellen Sie sicher, dass die relevanten ethischen Richtlinien eingehalten werden, und holen Sie die erforderlichen Genehmigungen für Forschungen ein, die menschliche Probanden betreffen.

Häufige Probentypen umfassen Stuhl, Speichel, Hautabstriche, Umweltproben (Boden, Wasser) und mehr. Jeder Probentyp kann spezifische Handhabungsprotokolle erfordern. Bitte konsultieren Sie unseren Leitfaden zur Probeneinreichung für weitere Details.

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Als Startmaterial benötigen wir von Ihnen Amplikons, welche die Mutationsstelle überspannen. Das Vorgehen zur Amplikongenerierung hängt von dem Produkttyp ab (Adaptor Ligation oder 2nd PCR Workflow). Instruktionen können Sie auf der Webseite auf dem Tab "Probenvorbereitung" finden. Anforderungen zur Amplikonlänge finden Sie auf dem Tab "Spezifikationen". 

Die Amplikonlänge (Wildtyp) muss an die Länge der InDels angepasst werden, die Sie detektieren möchten. Zudem muss die Amplikonlänge ein Merging überlappender Reads zulassen. Üblicherweise sind die Mutationen die Sie mit CRISPR (NHEJ Pathway) einführen im Bereich von 1-20 bp). Um auch größere InDels nicht von der Analyse auszuschließen muss die Wildtyp Amplikongrößer in einem bestimmten Größenbereich liegen.

Sie finden in unserem Sample Preparation Guide die Längenanforderungen für alle Produkttypen und für zwei Beispiel Anwendungsfälle. 

Ja, Sie können. In diesem Fall benötigen wir für die Analyse das Schnittstellen Offset (Distanz in Nukleotiden upstream der PAM Sequenz, bei der der Doppelstrangbruch erwartet wird).

1. Bitte fügen Sie immer mindestens eine Wildtyp Kontrollprobe in Ihr Experiment ein.
2. Wenn Sie eine sehr akkurate Bestimmung der Editing Efficiency benötigen, dann empfehlen wir Ihnen Replikate in die Analyse aufzunehmen. Replikate erhöhen die Genauigkeit der Effizienzbestimmung, sind aber nicht zwingend notwendig.

Beide Produkte sind exzelleente Lösungen um Mutationen zu untersuchen die mit dem CRISPR/Cas System (NHEJ pathway) eingeführt wurden.

The Produkte unterscheiden sich vor allem in der Library Generierung (2-Step Protokoll versus Adaptor Ligations Protokoll) and damit in der Amplikon-Probenvorbereitung. 

Ein Selection Guide ist auf der CRISPR Webseite verfügbar (Tab Overview) um Ihnen zu helfen die beste Lösung für Ihre individuellen Präferenzen und Gegebenheiten zu finden.

• Umfassender Bericht mit Abschnitten zu Ergebnissen und Methoden
• Rohdaten als FASTQ Dateien
• FASTQ Sequenzen nach Qualitäts-Clipping und Merging
• Gemappte Reads im BAM Format
• Sequenz des Wildtypallels und alternativer Allele inklusive deren Quantität 
• Metriken zu Rohdaten, Präprozessierungs-Daten, Mappingergebnisse und Coverage im CSV-Format
• Berechnete Editing Effizienz pro Probe

Leider nicht. Dieser Barcode wird für unsere internen Laborprozesse benötigt und ist wesentlich, um sicherzustellen, dass wir Ihre Proben so effizient wie möglich bearbeiten können. Vielen Dank für Ihre Mitarbeit!

Tolle Neuigkeiten! Wir arbeiten aktiv daran, Ihnen eine Prepaid-Lösung zu bringen, die in Kürze verfügbar sein wird!

Im Durchschnitt beträgt die Lieferzeit 5 - 7 Arbeitstage für alle Bakterien-Genome bis zu 7 Mb.

Es gibt mehrere Gründe, warum Ihre Ergebnisse von Ihren Erwartungen abweichen.

Um Ihre Ergebnisse zu interpretieren, werfen Sie einen Blick auf unser Problembehandlungshandbuch. Klicken Sie hier >>

Für jede Durchführung führen wir mehrere Qualitätskontrollmessungen durch, um den Erfolg der Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung zu bewerten. Wenn alle Messungen zufriedenstellende Ergebnisse anzeigen, werden wir Proben, die fehlgeschlagen sind, nicht erneut verarbeiten.

Gemäß den Spezifikationen von Oxford Nanopore für die v14 Library-Prep-Chemie und die derzeit in der bakteriellen Genomsequenzierung verwendeten R10.4.1-Flowcells übersteigt die Rohlesen-Genauigkeit 99%. Die Genauigkeit der endgültigen Assemblierung variiert je nach Abdeckung und Datenqualität. Im Allgemeinen führt eine höhere Abdeckung, die mehr Reads für den Konsensbau bedeutet, zu einer verbesserten Ergebnisgenauigkeit.

Dieser Service ist für eine klonale Population (eine einziger Stamm) von Bakterien konzipiert. Obwohl Sie Mischungen verschiedener bakterieller Stämme zur Sequenzierung einreichen können, geht dies mit einem gewissen Maß an Unsicherheit hinsichtlich des Assemblierungsergebnisses einher und erfolgt daher auf eigenes Risiko.

Wenn Sie an gemischten Proben interessiert sind, empfehlen wir die Nutzung eines unserer anderen Services:

- Mikrobiom-Profiling
- 16S-Volllängen-Sequenzierung
- INVIEW Resequencing von Bakterien
- Whole-Genome-Sequenzierung auf dem GridION (Illumina-Daten-Polishing möglich)

Wenn Ihre genomische DNA (gDNA)-Extraktion auch native Plasmid-DNA enthält, ist es wahrscheinlich, dass Sie Sequenzierungsreads für diese Plasmide erhalten. Im Allgemeinen werden DNA-Fragmente mit einer Größe von <1 kb während der Sequenzierung ausgeschlossen. Kleine, plasmidgroße Reads werden jedoch während der Assemblierung nicht herausgefiltert, daher besteht die Wahrscheinlichkeit, dass sie zu eigenen Plasmidassemblierungen beitragen, zusätzlich zur gDNA-Assemblierung.

Letztendlich hängt die Art der in Ihrer Probe enthaltenen DNA, die zu einer Assemblierung beiträgt, von der Gesamtqualität der Probe, der Abdeckung und dem relativen Vorkommen oder der Degradation jedes DNA-Typs ab.

Natürlich. Details zu unserem gesamten NGS ONT Portfolio finden sie hier>>

Die vorherrschenden Fehlermodi beim Oxford Nanopore-Sequenzieren umfassen Deletionen innerhalb von Homopolymer-Bereichen, Fehler, die an der zentralen Position der Dcm-Methylierungsstelle CCTGG oder CCAGG auftreten, sowie Fehler an der Dam-Methylierungsstelle GATC.

Bitte behandeln Sie diese Regionen daher besonders sorgfältig.

Für die DNA Präparation ist es ausreichend eine qualitativ hochwertige Säulenaufreinigung zu verwenden. Je besser die DNA Qualität, desto besser sind auch die Sequenzierungsergebnisse.

• Um unser wettbewerbsfähiges Produkt anbieten zu können, bündeln wir verschiedene Proben in Flowcell-Läufen und verwenden Flowcells nach dem Waschen zwischen den Läufen erneut. Beide Verfahren sind Industriestandard und werden gemäß den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt. 
• Durch das Barcode-Tagging und Pooling von Proben auf einer einzelnen Flowcell werden die Kosten gesenkt und die Nutzungseffizienz der Poren maximiert. Allerdings hat die Nanopore-Sequenzierung eine höhere Fehlerquote im Vergleich zur „traditionellen“ Next-Generation-Sequenzierung mit kurzen Reads, was zu Fehlinterpretationen in der Barcode-Sequenz und falscher Probenzusweisung/de-Multiplexierung mit einer Rate von bis zu 0,05% führen kann. Dieses Problem ist als Index-Hopping bekannt.
• Das Flowcell-Waschverfahren ist sehr effektiv, wobei nur bis zu 0,1% einer zuvor geladenen Probe eine nachfolgende Laufkontamination verursachen (bekannt als Carry-over-Kontamination), dennoch können einzelne kontaminierende Reads in Ihren Rohdaten auftreten.
• Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass bei sowohl Index-Hopping als auch Carry-over eine Kontamination dieses Niveaus die endgültige Sequenzassemblierung wahrscheinlich nicht beeinflusst, da mehrere fein abgestimmte Reinigungs- und Filterungsschritte angewendet werden, vorausgesetzt, Ihre Probe erfüllt unsere Qualitäts- und Quantitätsstandards und liefert daher eine ausreichende Anzahl an qualitativ hochwertigen Amplikon-Reads. Es ist wichtig zu beachten, dass das Problem bei Assemblierungen mit geringer Abdeckung am auffälligsten ist (siehe ‚Was ist die Abdeckung?‘).
• Falls Kundenproben nicht unseren Spezifikationen entsprechen, werden die Proben auf eigenes Risiko des Kunden sequenziert, und wir übernehmen keine Haftung für mögliche Schäden.
• Wenn Sie Bedenken bezüglich Kontaminationen haben und insbesondere darüber, dass Reads Ihrer Proben in den Rohdaten anderer Kunden erscheinen, bieten wir die Möglichkeit, unsere Premium-ONT-Dienste zu nutzen, die die Verwendung einer dedizierten vollständigen Flowcell für einzelne Kunden beinhalten (mehr erfahren >>).

Leider nicht. Dieser Barcode wird für unsere internen Laborprozesse benötigt und ist wesentlich, um sicherzustellen, dass wir Ihre Proben so effizient wie möglich bearbeiten können. Vielen Dank für Ihre Mitarbeit!

Die vorherrschenden Fehlermodi beim Oxford Nanopore-Sequenzieren umfassen Deletionen innerhalb von Homopolymer-Bereichen, Fehler, die an der zentralen Position der Dcm-Methylierungsstelle CCTGG oder CCAGG auftreten, sowie Fehler an der Dam-Methylierungsstelle GATC.

Bitte behandeln Sie diese Regionen daher besonders sorgfältig.

Abhängig von der Sequenz Ihres Probenmaterials kann der Assembler gelegentlich Schwierigkeiten bei der Rekonstruktion der terminalen Enden von linearer DNA haben, was dazu führen kann, dass bis zu 10 Nukleotiden an den 3'- und/oder 5'-Enden Ihres Inserts fehlen.

Wenn Sie dieses Problem bei Ihren Proben feststellen, können Sie die Rohdaten von Ihrem Dashboard herunterladen und die Enden mit Ihrer bevorzugten Methode rekonstruieren.

Für jeden Lauf führen wir mehrere Qualitätskontrollmessungen durch, um den Erfolg der Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung zu bewerten. Wenn alle Messungen zufriedenstellende Ergebnisse zeigen, werden wir Proben, die fehlgeschlagen sind, nicht erneut bearbeiten.

Wir bieten keine spezifische Abdeckungsgarantie an. Die Anzahl der generierten Rohdaten kann erheblich je nach Probenqualität variieren. Erfolgreiche Proben, die in der erforderlichen Konzentration eingesendet werden, ergeben in der Regel eine Anzahl von Rohsequenzierungsdaten im Bereich von Dutzenden bis zu Hunderten (oder sogar Tausenden).

Die durchschnittliche Abdeckung Ihrer Probe ist im Ergebnisbericht HTML enthalten, wobei eine Abdeckung von über ~20x auf einen sehr genauen Konsens hinweist.

Unser Amplicon-Service ist auf eine Population von Molekülen ausgelegt, die klonal ist.

Was passiert, wenn Sie Mischungen einsenden?

Wenn Ihre Arten ausreichend unterschiedlich sind (zum Beispiel in Größe oder Sequenz stark unterschiedlich), wird der Ablauf zunächst versuchen, eine .fasta-Konsensdatei aus der am häufigsten vorkommenden Art zu erstellen. Es wird auch versucht, einen Konsens für andere Arten zu erstellen, deren Lesanzahlen mehr als 20% derjenigen der am häufigsten vorkommenden Art entsprechen. Letztendlich hängt es von der Gesamtqualität der Probe, der Abdeckung und der relativen Häufigkeit/Abbau jeder Art ab, welche Arten einen Konsens erzeugen.

Wie kann ich meine Amplicon-Mischung sequenzieren lassen?

Eurofins Genomics bietet ein umfangreiches Portfolio für die Sequenzierung von Amplicons. Sie werden definitiv den passenden Service für Ihre Bedürfnisse finden: Amplicon-Portfolio >>

• Um unser wettbewerbsfähiges Produkt anbieten zu können, bündeln wir verschiedene Proben in Flowcell-Läufen und verwenden Flowcells nach dem Waschen zwischen den Läufen erneut. Beide Verfahren sind Industriestandard und werden gemäß den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt. 
• Durch das Barcode-Tagging und Pooling von Proben auf einer einzelnen Flowcell werden die Kosten gesenkt und die Nutzungseffizienz der Poren maximiert. Allerdings hat die Nanopore-Sequenzierung eine höhere Fehlerquote im Vergleich zur „traditionellen“ Next-Generation-Sequenzierung mit kurzen Reads, was zu Fehlinterpretationen in der Barcode-Sequenz und falscher Probenzusweisung/de-Multiplexierung mit einer Rate von bis zu 0,05% führen kann. Dieses Problem ist als Index-Hopping bekannt.
• Das Flowcell-Waschverfahren ist sehr effektiv, wobei nur bis zu 0,1% einer zuvor geladenen Probe eine nachfolgende Laufkontamination verursachen (bekannt als Carry-over-Kontamination), dennoch können einzelne kontaminierende Reads in Ihren Rohdaten auftreten.
• Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass bei sowohl Index-Hopping als auch Carry-over eine Kontamination dieses Niveaus die endgültige Sequenzassemblierung wahrscheinlich nicht beeinflusst, da mehrere fein abgestimmte Reinigungs- und Filterungsschritte angewendet werden, vorausgesetzt, Ihre Probe erfüllt unsere Qualitäts- und Quantitätsstandards und liefert daher eine ausreichende Anzahl an qualitativ hochwertigen Amplikon-Reads. Es ist wichtig zu beachten, dass das Problem bei Assemblierungen mit geringer Abdeckung am auffälligsten ist (siehe ‚Was ist die Abdeckung?‘).
• Falls Kundenproben nicht unseren Spezifikationen entsprechen, werden die Proben auf eigenes Risiko des Kunden sequenziert, und wir übernehmen keine Haftung für mögliche Schäden.
• Wenn Sie Bedenken bezüglich Kontaminationen haben und insbesondere darüber, dass Reads Ihrer Proben in den Rohdaten anderer Kunden erscheinen, bieten wir die Möglichkeit, unsere Premium-ONT-Dienste zu nutzen, die die Verwendung einer dedizierten vollständigen Flowcell für einzelne Kunden beinhalten (mehr erfahren >>).

Nein leider nicht. Unser Protokoll für den Hochdurchsatz von Amplikons ist nur für doppelsträngige DNA ausgelegt.

Aber natürlich haben wir ein weiteres Produkt das jegliche kundenspezifische Anpassung zulässt. Hier erfahren sie mehr >>

Es hängt wirklich von der Probenqualität ab. Wir können den Deckungsgrad derzeit nicht garantieren. Eine ordnungsgemäß eingereichte gute Probe ergibt normalerweise Hunderte oder sogar Tausende von Sequenzierungs-Reads. Die Konsensabdeckung hängt davon ab, wie viele Reads Volllängen-Amplikons sind und wie viele, falls vorhanden, abgebaut sind.

Eine Abdeckung unter 20x kann ungenau zusammengesetzte Amplikonsequenzen enthalten. Die häufigsten Gründe für Abdeckungen mit niedriger Qualität sind im Abschnitt "Fehlerbehebung bei fehlgeschlagenen Proben" aufgeführt.

Allgemeine FAQs im Bereich Next Generation Sequencing >>

• Whole Genome Sequenzierung (WGS)
• Vollängen 16S Sequenzierung
• Amplikon Sequenzierung
• Whole plasmid Sequenzierung

Nein, dies wird nicht empfohlen. Optimale Ergebnisse können erzielt werden, wenn die Fragmentierung direkt vor der Bibliotheksvorbereitung durchgeführt wird. Wir empfehlen, unfragmentierte HMW-DNA zu senden, möglichst groß.

Unser ONT Lite-Portfolio ist ein hochautomatisierter Hochdurchsatzprozess. Dies ermöglicht schnelle Durchlaufzeiten und günstige Preise.

Unser vollständiges ONT Lite-Portfolio finden Sie hier >>

Neben dem ONT Lite-Portfolio bieten wir äußerst flexible und anpassbare Dienstleistungen auf den GridION- und PromethION-Maschinen von Oxford Nanopore an. Dies reicht von Premium-Ganzgenomsequenzierung (z. B. große bakterielle Genome oder eukaryotische Genome) bis hin zur vollständigen 16S-Mikrobiomprofilierung oder nicht-klonalen / komplexen Amplikon-Sequenzierungsprojekten.

Um mehr über unsere Fähigkeiten zu erfahren, klicken Sie bitte hier >>

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Das Custom Long-Read Amplicon Sequencing widmet Ihren Amplicons eine ganze Flow-Zelle. Dadurch ist diese Methode zeitaufwendiger und kostspieliger im Vergleich zum ONT Lite Clonal Amplicon Sequencing Service, aber sie ist in den folgenden Fällen besonders geeignet:

- Wenn Sie zusätzliche Dienste wie 16S Mikrobiom-Analyse, Unique Sequence Analysis, Variant Analysis, Sequence Cleaning, Host Removal oder die Lieferung von Pod5-Rohdaten benötigen.
- Wenn Ihre lineare DNA-Probe nicht klonal ist, sondern eine Mischung verschiedener Moleküle enthält.
- Wenn vollständige, end-to-end Reads ohne Fragmentierung erforderlich sind.
- Wenn eine höhere Anzahl an Sequenzier-Reads benötigt wird, die über das typische Output des ONT Lite Clonal Amplicon Sequencing Service hinausgeht.
- Wenn Sie alle Roh-Reads erhalten möchten, die aus Ihrer Probe generiert wurden.

Wir empfehlen, Ihre Amplicons mit kommerziell erhältlichen Kits auf Basis von DNA-bindenden Beads oder Säulen oder durch enzymatische Reinigung zu reinigen. Bitte schicken Sie keine Primer mit Ihren Proben oder vermischt in Ihren Proben.

Ja, wir führen eine Qualitätskontrolle der Menge der Amplicons durch

• Rohdaten der Nanopore-Amplicon-Sequenzierungen (FASTQ) 
• Rohdaten der Nanopore-Sequenzierungen (POD5) auf Anfrage erhältlich (zusätzliche Kosten) 
• Kundenspezifische Datenanalyse-Pakete sind in unserem Bestellformular verfügbar
  • Variantenanalyse
    • Varianten (SNPs & InDels) Ergebnisse (TSV)
    • Analysebericht (HTML)
  • 16S-Mikrobiom-Analyse
    • OTU-Quantifizierungstabellen (TSV)
    • Analysebericht (HTML)
  • Analyse einzigartiger Sequenzen
    • Einzigartige Sequenzen (FASTA)
    • Cluster-Quantifizierungstabelle (TSV)
    • Analysebericht (HTML)
  • Konsensus-Sequenzanalyse
    • Konsensus-Sequenz (FASTA)
    • Varianten-Ergebnisse (TSV)
    • Analysebericht (HTML)

Verschiedene Analysen können während der Bestellung ausgewählt werden, darunter 16S-Mikrobiom-Analyse, Konsensus-Sequenzanalyse, Variantendetektion und Identifizierung einzigartiger Sequenzen, je nach den spezifischen Anforderungen Ihres Projekts. Wenn Sie eine spezielle Analyse benötigen, wenden Sie sich bitte an Ihren Vertriebsmitarbeiter.

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Wir empfehlen die Aufreinigung mit kommerziell erhältlichen Kits - basieren auf DNA-bindenden Beads oder mit Säulen.

Die Abdeckung wird mit folgender Formel berechnet:  

(Read-Länge) × (Gesamtanzahl der Reads) ÷ (Genom-Größe). 

Zum Beispiel: für die Sequenzierung eines 10Mb großen Genoms mit 20 M Reads bei einem Read-Modus von 2 x 150 bp beträgt die Abdeckung 60x.

Abhängig von Ihrer Fragestellung / dem Projekt empfehlen wir folgende Genomabdeckung (Coverage): 

• Keimbahn- und Analyse der häufigen Varianten: 20-50x 
• Somatische Mutationen und seltene Varianten: 100-1000x 
• De novo Assemblierung: 100-1000x  

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Wir empfehlen: New England Biolabs Monarch® Spin gDNA Extraction Kit, QIAGEN Genomic-tip-500/G, QIAGEN MagAttract HMW DNA Kit, QIAGEN Puregene Yeast/Bacteria Kit. Im Allgemeinen können alle Extraktionsmethoden verwendet werden, die die Erzeugung von HMW gDNA ermöglichen und die oben genannten Anforderungen erfüllen. Um sicherzustellen, dass HMW DNA extrahiert wird, empfehlen wir:

• Waschen Sie die Bakterienzellpellets vor der DNA-Extraktion mit PBS, um potenzielle Inhibitoren zu entfernen.
• Fügen Sie 1 ml PBS hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren.
• Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwerfen Sie den Überstand.
• Vermeiden Sie Vortexen und schnelles oder unnötiges Pipettieren; verwenden Sie nur Weithals-Spitzen.
• Eluieren Sie in nukleasefreiem Elutionspuffer, nicht in Wasser.
• Vermeiden Sie das Übertrocknen der gDNA.
• Setzen Sie die DNA nicht hohen Temperaturen (>37°C) für >1 Stunde aus.
• Verwenden Sie Puffer mit einem geeigneten pH-Wert von 7,5-8,5.
• Vermeiden Sie interkalierende fluoreszierende Farbstoffe oder UV-Strahlung.
• Vermeiden Sie Gefrier-Tau-Zyklen; lagern Sie gDNA bei 4°C für 1-2 Monate.

Kurze DNA-Fragmente sind typischerweise nicht ideal für Long-Read-Sequenzierungen, da sie zu einer schlechten Assemblierungsqualität führen können. Wir empfehlen, dass mindestens 50% der DNA länger als 15 kb sind. Um die Sequenzierungsergebnisse zu verbessern, empfehlen wir, kürzere DNA-Fragmente vor der Einreichung aus Ihrer Probe zu entfernen. Ein effektives Protokoll beinhaltet die Verwendung von 4-fach verdünnten SPRISelect-Perlen (35% Volumen/Volumen), um Fragmente kleiner als 3-4 kb zu eliminieren.

Bitte beachten Sie, dass die DNA-Menge nach diesem Prozess abnimmt, daher ist es wichtig, die verbleibende DNA zu quantifizieren, um sicherzustellen, dass genügend Material für die Sequenzierung vorhanden ist.

• Übertragen Sie jede Probe in ein sauberes 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind-Röhrchen.
• Verdünnen Sie SPRISelect-Beads mit Elutionspuffer auf 35% (Volumen/Volumen).
• Resuspendieren Sie die verdünnten SPRISelect-Beads durch Vortexen.
• Fügen Sie 4-faches Volumen der resuspendierten verdünnten SPRISelect-Beads zu jeder gDNA hinzu und mischen Sie durch Schwenken des Röhrchens.
• Inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
• Bereiten Sie ausreichend frisches 80% EtOH in nukleasefreiem Wasser für alle Ihre Proben vor.
• Zentrifugieren Sie die Proben und pelletieren Sie die Perlen auf einem Magneten, bis das Eluat klar und farblos ist. Halten Sie die Röhrchen auf dem Magneten und pipettieren Sie den Überstand ab.
• Halten Sie das Röhrchen auf dem Magneten und waschen Sie die Beads mit frisch zubereitetem 80% EtOH, ohne das Pellet zu stören. Das EtOH-Volumen muss ausreichen, um die Beads vollständig zu bedecken. Entfernen Sie das EtOH mit einer Pipette und verwerfen Sie es.
• Wiederholen Sie den vorherigen Schritt.
• Zentrifugieren Sie kurz und stellen Sie die Röhrchen zurück auf den Magneten, damit die Beads pelletieren. Pipettieren Sie das restliche EtOH ab. Lassen Sie es 30 Sekunden trocknen, aber trocknen Sie die Pellets nicht bis zum Reißen.
• Entfernen Sie die Röhrchen vom Magnetständer und resuspendieren Sie das Pellet in z.B. 50 µL nukleasefreiem 1xTE oder EB. Zentrifugieren Sie und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37°C mit sanfter Agitation (700 U/min) auf einem Schüttler.
• Pelletieren Sie die Perlen auf einem Magneten, bis das Eluat klar und farblos ist.
• Entfernen und behalten Sie das Eluat in sauberen 1,5 ml Eppendorf Safe Lock Tubes™.

Alternativ empfehlen wir die DNA-Reinigung und Größenselektion für Long-Read-Sequenzierungen von Jones et al. 2021 (Jones A, Torkel C, Stanley D, Nasim J, Borevitz J, et al. (2021) High-molecular weight DNA extraction, clean-up and size selection for long-read sequencing. PLOS ONE 16(7): e0253830. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0253830; https://www.protocols.io/view/dna-clean-up-and-size-selection-for-long-read-sequ-261ge6ymol47/v4).

Reinheit:

Phenol, Chloroform und andere verwandte Reagenzien hemmen die Bibliotheksvorbereitung und müssen vollständig entfernt werden. Obwohl spektrophotometrische Messungen möglicherweise nicht alle Arten von Verunreinigungen erkennen, empfehlen wir dringend, diese durchzuführen, um die Probenreinheit zu bewerten. Idealerweise sollte das 260/280-Verhältnis über 1,8 liegen und das 260/230-Verhältnis zwischen 2,0 und 2,2 liegen. Wenn die Probe kontaminiert ist und diese Metrik nicht erfüllt, extrahieren Sie die Probe entweder erneut oder reinigen Sie die Probe, um die Verunreinigungen mit einem Qiagen-Reinigungskit oder AMPure XP-Perlen zu entfernen. Die Probe darf kein RNA enthalten; wir empfehlen dringend eine RNase-Behandlung während der Extraktion.

• Darf keine Denaturierungsmittel (Guanidiniumsalze, Phenol usw.) oder Detergenzien (SDS, Triton-X100 usw.) enthalten.
• Darf keine Restverunreinigungen vom Organismus/Gewebe (Häm, Huminsäure, Polyphenole usw.) enthalten.
• Darf kein unlösliches Material enthalten oder gefärbt oder trüb sein.

Quantitative Bewertung

Bevorzugte Messmethode: fluoreszenzbasierte Methoden wie Qubit® (Invitrogen, Life Technologies), Quant-iT™ (Invitrogen) oder Quantifluor (Promega).

Wir raten dringend davon ab, Nanodrop zur Quantifizierung von gDNA zu verwenden.

HMW gDNA erfordert oft zusätzlichen Homogenisierungsaufwand (längere Inkubationszeit, erhöhte Inkubationstemperatur, sehr gründliches sanftes Mischen usw.), um eine genaue Quantifizierung zu erhalten. Wenn separate DNA-Quantifizierungen von oben und unten der Probe innerhalb von 15% voneinander liegen, ist dies normalerweise ein gutes Indiz für eine ausreichende Homogenität.

Wenn Sie weniger als die geforderte Menge an gDNA haben, empfehlen wir dringend, zusätzliche Extraktionen durchzuführen, um die Ausbeute zu erhöhen.

Qualitative Bewertung

Bevorzugte Messmethode: kapillarelektrophoresebasierte Methoden wie Fragment Analyzer oder Bioanalyzer. Hochmolekulare DNA ist größer als 15 kb und zeigt minimale Schmierung. Kontamination, Schäden und Abbau werden durch ein niedrigmolekulares Schmiermuster sichtbar und sollten mit alternativen Reinigungsstrategien wie oben beschrieben entfernt werden.

Nein, dies wird nicht empfohlen. Optimale Ergebnisse können erzielt werden, wenn die Fragmentierung direkt vor der Bibliotheksvorbereitung erfolgt. Es wird empfohlen, unfragmentierte HMW-DNA zu senden, so groß wie möglich

Abhängig von Ihrer Fragestellung / dem Projekt empfehlen wir folgende Genomabdeckung (Coverage): 

• Keimbahn- und Analyse der häufigen Varianten: 20-50x 
• Somatische Mutationen und seltene Varianten: 100x 
• De novo Assemblierung: 100x  

Die Datenausbeute hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, z.B. Organismus, Extraktionsmethode, DNA-Qualität, Größe, Handhabung und Lagerung. Daher kann ein erfolgreicher EntryQC keine hohe Sequenzierungsausbeute garantieren, da nicht alle Inhibitoren erkannt werden können.

Pflanzen können insbesondere hohe Mengen an sekundären Metaboliten enthalten, die den Sequenzierungsprozess stören können. Diese Verbindungen können während der Vorverarbeitung schwer zu erkennen und zu entfernen sein, was zu potenziellen Problemen bei der Sequenzierungsausbeute und der Datenqualität führen kann.

Basierend auf unseren Erfahrungen können Sie im Allgemeinen etwa 50-80 Gb Daten pro PromethION-Flow-Cell und ungefähr 6-7 Gb pro GridION-Flow-Cell erwarten. Diese Ausbeuten hängen von Faktoren wie DNA-Qualität und Fragmentlänge ab.

Oxford Nanopore selbst gibt für die Flow Cells und Chemie, die wir derzeit nutzen folgende Werte an: Roh-Daten Genauigkeit >Q20 (>99%) und die Konsensus-Genauigkeit ist typischerweise größer als 99.99% .

Siehe auch https://nanoporetech.com/platform/accuracy

Die vorherrschenden Fehlermodi beim Oxford Nanopore-Sequenzieren umfassen Deletionen innerhalb von Homopolymer-Bereichen, Fehler, die an der zentralen Position der Dcm-Methylierungsstelle CCTGG oder CCAGG auftreten, sowie Fehler an der Dam-Methylierungsstelle GATC.

Bitte behandeln Sie diese Regionen daher besonders sorgfältig.

Nein, wir können keine Garantien für die Assemblierungsqualität geben. Allerdings wird bei Verwendung von hochwertiger Eingangs-DNA mit kleinen und nicht allzu komplizierten Genomen normalerweise ein einzelnes Contig erzeugt.

Ja das ist möglich. Bitte sprechen sie uns an.