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Direct Colony Sequencing Service

 

 

Direkte Sequenzierung von Bakterienkolonien durch "Rolling Circle Amplification"

 


Der Direct Colony Sequencing Service verwendet die Rolling Circle Amplification, die eine schnelle Sequenzierung von Plasmidklonen in 96well-Platten ermöglicht, da keine Plasmidpräparation erforderlich ist.

 

 

 

 

 

 

Highlights unseres Direct Colony Sequencing Service:

 

Schnell
Erhalten Sie Ihre Sequenzierungsergebnisse einen Tag früher für Ihre Plasmidklone, da keine DNA-Präparation erforderlich ist. Die Ergebnisse erhalten Sie nach 15 Stunden nach Probeneingang.

Praktisch
Mit unserer PlateSeq Kit Colony erhalten Sie alles Zubehör, das Sie benötigen, um Ihre Bakterienkolonien entweder aus Agar-Kolonien oder als Flüssigkultur zu versenden. 

Flexibel
Sie erhalten unseren Colony Sequencing Service mit unserem PlateSeq Kit Colony als Prepaid-Variante und als Nicht-Prepaid-Option mit unserer ColonySeq Plate. Um zusätzliche Reaktionen im Voraus zu bezahlen, können Sie unsere Plate Coupons verwenden.

Kosteneffizient
Reduzieren Sie Ihre Kosten für die Plasmid-DNA-Isolierung und lassen Sie uns Ihre Kolonien direkt sequenzieren.

Ihre Vorteile auf einen Blick:

 

 

  • Verfügbar für E.coli-Kolonien oder andere gramnegative Bakterien
  • Bis zu 4 Reads können pro Probe definiert werden
  • Sie erhalten Leseweiten von bis zu 1.100 Basen
  • Die Ergebnisse liegen 15 Stunden nach Erhalt der Proben vor
  • Eine kostenlose Wiederholung bei technischen Ursachen*
  • Dateiformate der Sequenzierergebnisse sind pro Auftrag wählbar
  • Eine Vielzahl an Standardprimern sind kostenlos erhältlich
  • Sequenzierungsprimer können bestellt oder beigelegt werden
  • Einfache Nachbestellung aus gelagerter DNA

 

 

 

 

 

 

 

 

Weiterführende Informationen

 

Technische Information (englisch)

Introduction


You have prepared your DNA construct, cloned it into a vector and transformed E. coli with it. Now it is time to pick and grow the colonies and conduct minipreps in order to extract plasmids to send for sequencing. Confirmation of a construct’s presence and identification of the construct in the vectors is absolutely essential before you continue to work with the plasmids. However, this process is quite laborious and time-consuming, especially when there are a large number of colonies to check.

 

You can save time by using the Direct Colony Sequencing solution. This Sanger sequencing service in 96-well plates conveniently sequences the plasmids/vectors directly from bacterial colonies without the need for plasmid preparation.


You just need to pick the colonies and directly transfer them to the 96-well plate that comes with the service. The wells of this plate contain buffer to preserve the colonies.


This fast and cost-effective solution can be used to quickly screen your DNA cloning experiments and select the candidate(s) for final confirmation via DNA preparation and sequencing.

 

What is the basis of Direct Colony Sequencing and why does this sequencing solution work without plasmid preparation?

 

Rolling circle amplification process

The basis for the Direct Colony Sequencing solution is the rolling circle amplification (RCA) technique that generates multiple copies of circular DNA.


The rolling circle amplification (RCA) method utilises bacteriophage Phi29 DNA polymerase to exponentially amplify single- or double-stranded circular DNA templates. The isothermal amplification method produces microgram quantities of DNA from picogram amounts of starting material in a few hours.


An in vitro amplification of very small amounts of template DNA eliminates the need for overnight cell culture and conventional plasmid or M13 bacteriophage DNA purification. The proofreading activity of the Phi9 DNA polymerase ensures high fidelity DNA replication.

 

Starting material

The starting material for amplification can be of various sources, such as from a small number of bacterial cells containing a plasmid, isolated plasmids and intact M13 phages to any circular DNA (including ligation reactions).

Bacterial colonies can be picked from agar plates and added directly to the 96-well plate. Alternatively, microlitre quantities of a saturated bacterial culture or a glycerol stock can also serve as starting material.


Process

RCA is performed at 30°C without thermal cycling. Depending on the source of starting material, amplification is completed in 6 to 18 hours. The amplification products are double-stranded concatemers of the circular template with high molecular weight. Concatemers are large DNA molecules that contain many copies of a specific DNA sequence.

For RCA, random hexamer primers anneal to the circular single-strand template DNA at multiple sites. The Phi29 DNA polymerase extends each of these primers. When Phi29 reaches a downstream extended primer, strand displacement synthesis occurs. Here, the original single-stranded DNA is replaced by the newly replicated strand. The displaced strand is then available to be primed by more hexamer primer. The process results in exponential amplification.

Note: when starting with M13 bacteriophage clones, the product is double-stranded DNA and can be sequenced with forward and reverse primers. DNA amplified by the method can be used directly without any purification.

 

 

The Direct Colony Sequencing service has been validated primarily for plasmids in E. coli colonies. In principle, the method also works with large constructs (e.g. BACs) and other organisms. Contact us for pilot testing and optimisation. As a starting point, we recommend performing cell lysis or crude DNA extraction and adding 1 to 5 µL of the lysate/extract to the buffer in the 96-well plates.

 

References

Dean, F. et al., Genome Research 11, 1095–1099 (2001).

Lizardi, P. et al., Nat. Genet. 19, 225–232 (1998).

Estaban, J.A. et al., J. Biol. Chem. 268, 2719–2726 (1993).

 

 

Probenvorbereitung & Versand



So senden Sie uns Ihre Proben für unseren Direct Colony Sequencing Service

  • Bitte bestellen Sie zuerst entweder unser PlateSeq Kit Colony oder den ColonySeq Plate (Beide Platten enthalten den entsprechenden Puffer).
  • Zentrifugieren Sie kurz die erhaltene Platte, um Flüssigkeit auf der Folie zu vermeiden. Entfernen Sie vorsichtig die Folie von der Platte
  • Lassen Sie Ihre Bakterienkolonien auf der Agarplatte lang genug wachsen, um einen Koloniedurchmesser von mindestens 1 mm * zu erhalten
  • Verwenden Sie einen Zahnstocher, um so viel wie möglich von der Kolonie in die Platte zu impfen. Schwenken Sie den Zahnstocher einige Sekunden lang, um so viele Zellen wie möglich in die einzelnen Wells zu übertragen
  • Im Falle einer Bakteriensuspension, pipettieren Sie 5 µl der Flüssigkultur in jedes Well
  • Well-Position H12 sollte für unsere interne Qualitätskontrolle frei gehalten werden
  • Versiegeln Sie Ihre Platten mit 8-Cap-Strips, um Materialverlust zu vermeiden (8-Cap-Strips werden zusammen mit jedem PlateSeq Kit Colony mitgeliefert).
  • Versenden Sie Ihre Platten bei Umgebungstemperatur an unser Sequenzierlabor

 

*Wir empfehlen, direkt nach dem Züchten eine Kopie Ihrer E.coli-Kolonien zu erstellen. Verwenden Sie denselben Zahnstocher, um antibiotikahaltige LB-Medien zu inokulieren, um eine Übernachtkultur zu erzeugen, oder streichen Sie sie auf einer frischen Agarplatte aus..

 

 

 

Sequenzier-Primer

Profitieren Sie von größtmöglicher Flexibilität für Ihre Sequenzier-Primer

Dank unserer hauseigenen DNA-Synthese, unserer umfassenden Bioinformatik-und IT-Expertise haben Sie die freie Wahl, wie Sie uns Ihre Sequenzier-Primer zukommen lassen:

  • Mehr als 80 Standard Primer stehen Ihnen zur Verfügung
    Wählen und verwalten Sie Ihre bevorzugten Standard Primer aus einer Liste von 80 validierten Primern.
  • Designen Sie Ihre eigenen Sequenzier-Primer
    Verwenden Sie unser Sequenzier Primer Design Tool für Ihre forward und reverse Primer die Sie anschließen einfach bestellen können.
  • Bestellen Sie Ihre eigenen Sequenzier-Primer
    Bestellen Sie die Synthese benötigter Primer direkt zu Ihrer Sequenzierung. Wir bewahren diese Primer 4 Wochen für Sie auf. In diesem Zeitraum können Sie sie jederzeit bequem wiederverwenden.
  • Schicken Sie uns Ihre eigenen Sequenzier-Primer
    Sie können uns Ihre Sequenzier-Primer in separaten Tubes gemeinsam mit Ihrer Proben schicken. Verwenden Sie dafür unsere kostenlosen Primer Barcodes.*

 


Bitte beachten Sie die optimalen Primerbedingungen, Konzentration und Volumen wie unten beschrieben.

Optimale Primer-Bedingungen:

  • Primer dürfen weder Phosphorylierung noch Fluoreszenzfarbstoffe enthalten
  • Die optimale Primerlänge liegt zwischen 16 und 25 Basen
  • Die Schmelztemperatur des Primers sollte 50 - 62°C betragen
  • Der GC-Gehalt des Primers sollte bei 35-60% liegen
  • Idealerweise sollte ein G oder C am 3’-Ende liegen
  • Die Anzahl der 3' Gs oder Cs sollte nicht größer als 2 Gs oder Cs sein
  • Wenn möglich, vermeiden Sie >3 identische Basen hintereinander in der Sequenz


Primer-Konzentration und -Volumen:

  • Pro Sequenzierreaktion werden exakt 10 pmol/µl Primer-Konzentration benötigt
  • Jeder Primer muss ein Gesamtvolumen von 15 µl (in bi-destilliertem Wasser oder 5mM Tris-HCl) haben; für jede weitere Sequenzierreaktion sind 5 µl Primer-Volumen erforderlich
  • Die Konzentration von Primern mit Wobbles muss nach folgender Formel berechnet werden: nX x ConcPrimer

    n = Anzahl Basen im Wobble gem. IUPC-Code, X = Anzahl Wobbles in der Primer-Sequenz. [z.B. 1 V (AGC) = 31 x 10 pmol/µl; 2 V (AGC) (AGC) = 32 x10 pmol/µl]

*: Bereits vorhandene Tube Labels können weiterhin für mitgesendete Primer verwendet werden

 

 

Aufbewahrungszeiten

 

Aufbewahrung von Proben und Primer:

  • Lagerung der DNA für 4 Wochen
  • Kostenlose Lagerung der synthetisierten Primer für 4 Wochen
  • Aufbewahrung von synthetisierten Primern für ein Jahr gegen Aufpreis

 

Datenspeicherung:

  • Sichere Online-Archivierung aller ausgewählten Sequenzdaten für 6 Monate
    (Bei Bestellungen die in Ebersberg bearbeitet werden, werden die Daten 3 Monate gespeichert)

 

Wiederholung bei technischen Ursachen

Definition technische Ursachen

Ein technischer Fehler ist als ein chemischer oder technischer Defekt (IT, Maschinen) in unserem Labor definiert. Um zu gewährleisten, dass die Qualität der Sequenzierung einer Platte nicht von einem technischen Fehler betroffen ist, wird bei jeder Platte eine interne Qualitätskontrolle durchgeführt (Well H12 sollte zu diesem Zweck leer gehalten werden, ansonsten kann eine Qualitätskontrolle erfolgen). Darüber hinaus analysiert eine hochentwickelte Software jede einzelne Platte unter Berücksichtigung verschiedener Parameter wie Qualitätswerte (QV) und Leselängen. Falls diese Parameter einen bestimmten Wert pro Platte unterschreiten wird eine zusätzliche manuelle Überprüfung durchgeführt. Wenn durch diese manuelle Prüfung ein technischer Fehler bestätigt wird, wird die Platte neu sequenziert.

 

 

 

Literatur

 

 

 

 

 

 

 

 

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