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Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen

Die passende Antwort auf häufig gestellte Fragen

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Allgemeine Fragen zur Probenübermittlung, Bestellung, zum Probenversand und zu Ergebnissen finden Sie hier:

Allgemeine FAQs im Bereich Next Generation Sequencing >>

Wie soll ich meine DNA aufreinigen?

Wir empfehlen: New England Biolabs Monarch® Spin gDNA Extraction Kit, QIAGEN Genomic-tip-500/G, QIAGEN MagAttract HMW DNA Kit, QIAGEN Puregene Yeast/Bacteria Kit. Im Allgemeinen können alle Extraktionsmethoden verwendet werden, die die Erzeugung von HMW gDNA ermöglichen und die oben genannten Anforderungen erfüllen. Um sicherzustellen, dass HMW DNA extrahiert wird, empfehlen wir:

  • Waschen Sie die Bakterienzellpellets vor der DNA-Extraktion mit PBS, um potenzielle Inhibitoren zu entfernen.
  • Fügen Sie 1 ml PBS hinzu und resuspendieren Sie die Zellen durch Pipettieren.
  • Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation und verwerfen Sie den Überstand.
  • Vermeiden Sie Vortexen und schnelles oder unnötiges Pipettieren; verwenden Sie nur Weithals-Spitzen.
  • Eluieren Sie in nukleasefreiem Elutionspuffer, nicht in Wasser.
  • Vermeiden Sie das Übertrocknen der gDNA.
  • Setzen Sie die DNA nicht hohen Temperaturen (>37°C) für >1 Stunde aus.
  • Verwenden Sie Puffer mit einem geeigneten pH-Wert von 7,5-8,5.
  • Vermeiden Sie interkalierende fluoreszierende Farbstoffe oder UV-Strahlung.
  • Vermeiden Sie Gefrier-Tau-Zyklen; lagern Sie gDNA bei 4°C für 1-2 Monate.

Kurze DNA-Fragmente sind typischerweise nicht ideal für Long-Read-Sequenzierungen, da sie zu einer schlechten Assemblierungsqualität führen können. Wir empfehlen, dass mindestens 50% der DNA länger als 15 kb sind. Um die Sequenzierungsergebnisse zu verbessern, empfehlen wir, kürzere DNA-Fragmente vor der Einreichung aus Ihrer Probe zu entfernen. Ein effektives Protokoll beinhaltet die Verwendung von 4-fach verdünnten SPRISelect-Perlen (35% Volumen/Volumen), um Fragmente kleiner als 3-4 kb zu eliminieren.

Bitte beachten Sie, dass die DNA-Menge nach diesem Prozess abnimmt, daher ist es wichtig, die verbleibende DNA zu quantifizieren, um sicherzustellen, dass genügend Material für die Sequenzierung vorhanden ist.

  • Übertragen Sie jede Probe in ein sauberes 1,5 ml Eppendorf DNA LoBind-Röhrchen.
  • Verdünnen Sie SPRISelect-Beads mit Elutionspuffer auf 35% (Volumen/Volumen).
  • Resuspendieren Sie die verdünnten SPRISelect-Beads durch Vortexen.
  • Fügen Sie 4-faches Volumen der resuspendierten verdünnten SPRISelect-Beads zu jeder gDNA hinzu und mischen Sie durch Schwenken des Röhrchens.
  • Inkubieren Sie 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  • Bereiten Sie ausreichend frisches 80% EtOH in nukleasefreiem Wasser für alle Ihre Proben vor.
  • Zentrifugieren Sie die Proben und pelletieren Sie die Perlen auf einem Magneten, bis das Eluat klar und farblos ist. Halten Sie die Röhrchen auf dem Magneten und pipettieren Sie den Überstand ab.
  • Halten Sie das Röhrchen auf dem Magneten und waschen Sie die Beads mit frisch zubereitetem 80% EtOH, ohne das Pellet zu stören. Das EtOH-Volumen muss ausreichen, um die Beads vollständig zu bedecken. Entfernen Sie das EtOH mit einer Pipette und verwerfen Sie es.
  • Wiederholen Sie den vorherigen Schritt.
  • Zentrifugieren Sie kurz und stellen Sie die Röhrchen zurück auf den Magneten, damit die Beads pelletieren. Pipettieren Sie das restliche EtOH ab. Lassen Sie es 30 Sekunden trocknen, aber trocknen Sie die Pellets nicht bis zum Reißen.
  • Entfernen Sie die Röhrchen vom Magnetständer und resuspendieren Sie das Pellet in z.B. 50 µL nukleasefreiem 1xTE oder EB. Zentrifugieren Sie und inkubieren Sie 10 Minuten bei 37°C mit sanfter Agitation (700 U/min) auf einem Schüttler.
  • Pelletieren Sie die Perlen auf einem Magneten, bis das Eluat klar und farblos ist.
  • Entfernen und behalten Sie das Eluat in sauberen 1,5 ml Eppendorf Safe Lock Tubes™.

Alternativ empfehlen wir die DNA-Reinigung und Größenselektion für Long-Read-Sequenzierungen von Jones et al. 2021 (Jones A, Torkel C, Stanley D, Nasim J, Borevitz J, et al. (2021) High-molecular weight DNA extraction, clean-up and size selection for long-read sequencing. PLOS ONE 16(7): e0253830. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0253830; https://www.protocols.io/view/dna-clean-up-and-size-selection-for-long-read-sequ-261ge6ymol47/v4).

 

Reinheit:

Phenol, Chloroform und andere verwandte Reagenzien hemmen die Bibliotheksvorbereitung und müssen vollständig entfernt werden. Obwohl spektrophotometrische Messungen möglicherweise nicht alle Arten von Verunreinigungen erkennen, empfehlen wir dringend, diese durchzuführen, um die Probenreinheit zu bewerten. Idealerweise sollte das 260/280-Verhältnis über 1,8 liegen und das 260/230-Verhältnis zwischen 2,0 und 2,2 liegen. Wenn die Probe kontaminiert ist und diese Metrik nicht erfüllt, extrahieren Sie die Probe entweder erneut oder reinigen Sie die Probe, um die Verunreinigungen mit einem Qiagen-Reinigungskit oder AMPure XP-Perlen zu entfernen. Die Probe darf kein RNA enthalten; wir empfehlen dringend eine RNase-Behandlung während der Extraktion.

  • Darf keine Denaturierungsmittel (Guanidiniumsalze, Phenol usw.) oder Detergenzien (SDS, Triton-X100 usw.) enthalten.
  • Darf keine Restverunreinigungen vom Organismus/Gewebe (Häm, Huminsäure, Polyphenole usw.) enthalten.
  • Darf kein unlösliches Material enthalten oder gefärbt oder trüb sein.

Wie soll ich meine DNA Konzentration und Größe bestimmen?

Quantitative Bewertung

 

Bevorzugte Messmethode: fluoreszenzbasierte Methoden wie Qubit® (Invitrogen, Life Technologies), Quant-iT™ (Invitrogen) oder Quantifluor (Promega).

Wir raten dringend davon ab, Nanodrop zur Quantifizierung von gDNA zu verwenden.

HMW gDNA erfordert oft zusätzlichen Homogenisierungsaufwand (längere Inkubationszeit, erhöhte Inkubationstemperatur, sehr gründliches sanftes Mischen usw.), um eine genaue Quantifizierung zu erhalten. Wenn separate DNA-Quantifizierungen von oben und unten der Probe innerhalb von 15% voneinander liegen, ist dies normalerweise ein gutes Indiz für eine ausreichende Homogenität.

Wenn Sie weniger als die geforderte Menge an gDNA haben, empfehlen wir dringend, zusätzliche Extraktionen durchzuführen, um die Ausbeute zu erhöhen.

 

Qualitative Bewertung

 

Bevorzugte Messmethode: kapillarelektrophoresebasierte Methoden wie Fragment Analyzer oder Bioanalyzer. Hochmolekulare DNA ist größer als 15 kb und zeigt minimale Schmierung. Kontamination, Schäden und Abbau werden durch ein niedrigmolekulares Schmiermuster sichtbar und sollten mit alternativen Reinigungsstrategien wie oben beschrieben entfernt werden.

Kann ich auch schon fragmentierte DNA schicken?

Nein, dies wird nicht empfohlen. Optimale Ergebnisse können erzielt werden, wenn die Fragmentierung direkt vor der Bibliotheksvorbereitung erfolgt. Es wird empfohlen, unfragmentierte HMW-DNA zu senden, so groß wie möglich

Wie viel Sequenzierdaten benötige ich?

Abhängig von Ihrer Fragestellung / dem Projekt empfehlen wir folgende Genomabdeckung (Coverage): 

  • Keimbahn- und Analyse der häufigen Varianten: 20-50x 
  • Somatische Mutationen und seltene Varianten: 100x 
  • De novo Assemblierung: 100x  

Wieviel Daten kann ich erhalten?

Die Datenausbeute hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, z.B. Organismus, Extraktionsmethode, DNA-Qualität, Größe, Handhabung und Lagerung. Daher kann ein erfolgreicher EntryQC keine hohe Sequenzierungsausbeute garantieren, da nicht alle Inhibitoren erkannt werden können.

Pflanzen können insbesondere hohe Mengen an sekundären Metaboliten enthalten, die den Sequenzierungsprozess stören können. Diese Verbindungen können während der Vorverarbeitung schwer zu erkennen und zu entfernen sein, was zu potenziellen Problemen bei der Sequenzierungsausbeute und der Datenqualität führen kann.

Basierend auf unseren Erfahrungen können Sie im Allgemeinen etwa 50-80 Gb Daten pro PromethION-Flow-Cell und ungefähr 6-7 Gb pro GridION-Flow-Cell erwarten. Diese Ausbeuten hängen von Faktoren wie DNA-Qualität und Fragmentlänge ab.

Wie genau sind die Sequenzierungsergebnisse?

Oxford Nanopore selbst gibt für die Flow Cells und Chemie, die wir derzeit nutzen folgende Werte an: Roh-Daten Genauigkeit >Q20 (>99%) und die Konsensus-Genauigkeit ist typischerweise größer als 99.99% .

Siehe auch https://nanoporetech.com/platform/accuracy

Wie sollen die Fehler bewertet werden, die ich einer Homopolymeregion oder an einer Dam- oder Dcm-Methylierungsstelle entdeckt habe?

Die vorherrschenden Fehlermodi beim Oxford Nanopore-Sequenzieren umfassen Deletionen innerhalb von Homopolymer-Bereichen, Fehler, die an der zentralen Position der Dcm-Methylierungsstelle CCTGG oder CCAGG auftreten, sowie Fehler an der Dam-Methylierungsstelle GATC.

Bitte behandeln Sie diese Regionen daher besonders sorgfältig.

Garantieren Sie eine bestimmte Assemblierungsqualität?

Nein, wir können keine Garantien für die Assemblierungsqualität geben. Allerdings wird bei Verwendung von hochwertiger Eingangs-DNA mit kleinen und nicht allzu komplizierten Genomen normalerweise ein einzelnes Contig erzeugt.

Ist es mit ONT möglich den Methylierungsstatus zu bestimmen.

Ja das ist möglich. Bitte sprechen sie uns an.

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