Häufig gestellte Fragen zu Produkten und Dienstleistungen

Allgemeine FAQs im Bereich Next Generation Sequencing >>

Dies hängt von vielen Faktoren ab, wie u. a. von der Art der Gewebes, der Probenqualität, dem Entwicklungsstadium, den vorhandenen Sequenzen usw.. Entnehmen Sie bitte der Tabelle unter „Produktspezifikationen“ Ihre optimale INVIEW Transcriptome-Lösung. Die dort angegebenen geschätzten Read-Anzahlen beziehen sich auf humane Proben. Alternativ können Sie uns kontaktieren, um Ihr Projekt mit uns zu besprechen. In bestimmten Fällen ist es möglicherweise ratsam, mit Hilfe eines Testlaufs zu ermitteln, wie viele Reads für Ihren speziellen Zweck oder Organismus benötigt werden.

Das INVIEW Transcriptome Discover verwendet eine strangspezifische RNA-Library kombiniert mit 150 bp Paired-End-Sequenzierung von Illumina. Somit empfiehlt sich das Paket für die Erkennung von differenziell exprimierten Genen, seltenen und neuen Transkripten sowie für die Entdeckung von Spleißvarianten. Darüber hinaus ermöglichen die Informationen über die Orientierung des Transkripts eine präzisere Bestimmung von Struktur und Genexpression.

Das INVIEW Transcriptome Bacteria beinhaltet 10 Millionen Reads / Read Paare und ist somit günstiger als das INVIEW Transcriptome Explore / Discover. 10 Millionen Reads / Read Paare sind aber für die meisten Untersuchungen bakterieller RNA völlig ausreichend.

Das INVIEW Transcriptome Ultra Low ist speziell für Projekte mit nur sehr sehr wenig Ausgangsmaterial entwickelt.

INVIEW Transcriptome Discover:

Nicht unbedingt. Sollten Sie jedoch eine Referenz haben, nehmen Sie bitte die folgenden Empfehlungen unten zur Kenntnis.

INVIEW Transcriptome Bacteria / Ultra Low:

Ein klar definierter Ensembl-Name (z. B. GRCh37 oder Rnor_5.0) für die annotierte genomische Referenzsequenz muss vor Projektbeginn zur Verfügung gestellt werden. Alternativ kann die Genomsequenz in Fasta bereitgestellt werden (zusammen mit der entsprechenden Annotation im Gene Transfer Format (GTF) oder im GenBank-Format, einschließlich Annotation).

Zur Erstellung von Libraries für die Sequenzierung kann Gesamt-RNA aus Gewebe, Zellen oder Körperflüssigkeiten von eukaryotischen oder prokaryotischen Organismen verwendet werden. Zusätzlich zu aus frischem Gewebe isolierter RNA kann auch RNA aus FFPE-Proben analysiert werden. RNA-Isolation kann als Zusatzleistung angeboten werden. Bei Fragen zu Ausgangsmaterial aus anderen Quellen sprechen Sie uns bitte an.

Für das INVIEW Transcriptome Ultra Low können wir keine Zellen in Zellkultur annehmen. Desweiteren können wir hier nicht garantieren, das genug RNA extrahiert werden kann.

Informationen über die für spezielle Methoden der Library-Erstellung benötigte RNA-Menge und -Konzentration finden Sie in Ihrem Angebot – oder Sie wenden sich an uns. In der Regel benötigen wir für optimale Ergebnisse 150 ng hochwertige RNA (bis zu 15 μl / optimale Konzentration 6 - 50 ng / μl (maximale Konzentration 200 ng / μl) mit einer OD 260/280 von 1,8 – 2,0 und einer OD 260/230 von 2,0 – 2,2. Möglicherweise kann mit weniger Material begonnen werden, doch dies hängt in hohem Maß von der Qualität des Materials und der gewünschten Library ab.
Die Qualität und Quantität des bereitgestellten Ausgangsmaterials sind für den Erfolg der Probenvorbereitung entscheidend. Bei Verwendung von zu wenig oder degradiertem, kontaminiertem oder anderweitig geschädigtem Ausgangsmaterial kann die Folge ein sehr niedriger Ertrag, eine fehlgeschlagene Probenvorbereitung sowie eine beeinträchtigte Qualität und Quantität der Sequenzierungsergebnisse sein.

Für das INVIEW Transcriptome Ultra Low:

Mindestens 0.15 ng/µl (in min. 10 µl). RIN > 6.5

Eurofins Genomics bietet RNA-Isolation als Zusatzleistung an. Wir haben die Protokolle zur Extraktion von qualitativ hochwertiger RNA aus mehreren Probenarten und Ausgangsmaterialien erfolgreich optimiert. Weitere Informationen zur RNA-Isolation finden Sie in den Produktspezifikationen – oder lassen Sie sich von uns direkt beraten: Wir besprechen mit Ihnen mögliche Methoden der Probenvorbereitung für Ihre individuellen Anforderungen.

a) Für Eukaryoten: Eine rRNA-Abreicherung empfiehlt sich für teilweise degradierte RNA oder bei Sequenzierung der RNA ohne Poly-A-Schwanz.

b) Für Prokaryoten empfehlen wir generell eine rRNA-Abreicherung, da eine poly-(A)-Anreicherung von prokaryotischen Transkripten nicht durchführbar ist.

Eine rRNA-Abreicherung kann bei Eurofins Genomics angefordert werden. Alternativ können Sie uns eine bereits rRNA-abgereicherte/mRNA-angereicherte RNA als Ausgangsmaterial zur Verfügung stellen (20 ng pro Probe (bis zu 15 µl / Konzentration >1,4 ng/µl)). Weitere Informationen finden Sie in den Produktspezifikationen

Die Effizienz der RNA-Entfernung richtet sich nach dem Organismus, der Zusammensetzung und der Qualität Ihrer Proben-RNA. Bei stark degradierter RNA kann eine Ribo-Abreicherung weniger effizient sein.

RNA muss auf Trockeneis versandt werden, sofern sie nicht mit Ethanol ausgefällt wurde. Gewebe/Zellkulturen müssen in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis schockgefroren und auf Trockeneis versandt werden. Alternativ kann frisches Material in „RNAlater“ (z. B. von Ambion, SIGMA oder QIAGEN) stabilisiert und bei Raumtemperatur versandt werden. Bitte prüfen Sie im Voraus, ob der von Ihnen beauftragte Kurier Trockeneisversand anbietet.

Da ribosomale RNA (rRNA) den Großteil einer Gesamt-RNA-Probe ausmacht, empfehlen wir, sie zu entfernen, um die Probe für andere RNA-Typen anzureichern. Dies kann entweder durch eine Poly-A-Selektion oder eine rRNA-Depletion erreicht werden, beide Methoden helfen, die Analyse auf informativere RNA-Populationen zu konzentrieren.

RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist ein leistungsstarkes Werkzeug zur Transkriptomanalyse, und die Wahl zwischen PolyA-Anreicherung und rRNA-Depletion hängt von den spezifischen Zielen des Experiments und den Arten von RNA ab, die Sie untersuchen möchten. Hier ist eine Übersicht, wann jede Methode sinnvoll ist:

1. PolyA-Anreicherung

PolyA-Anreicherung isoliert selektiv mRNA, indem sie an die PolyA-Schwänze bindet, die am 3'-Ende der meisten eukaryotischen mRNAs zu finden sind. Dies ist nützlich, wenn Sie hauptsächlich an kodierender RNA (mRNA) interessiert sind, und vereinfacht die Analyse, indem die Komplexität der Probe reduziert wird.

Wann sollte man PolyA-Anreicherung verwenden?

• Fokus auf mRNA: Wenn Ihr Ziel darin besteht, protein-kodierende Gene zu analysieren, ist die PolyA-Anreicherung ideal, da sie die meisten mRNAs mit einem PolyA-Schwanz erfasst (was den Großteil des Transkriptoms in eukaryotischen Zellen ausmacht).
• Eukaryotische Proben: Die meisten eukaryotischen mRNAs haben PolyA-Schwänze, was die PolyA-Anreicherung besonders nützlich für diese Spezies macht.
• Reduzierung der rRNA-Interferenz: In RNA-Proben mit hohem rRNA-Gehalt hilft die PolyA-Anreicherung, die rRNA-Kontamination zu reduzieren, indem sie selektiv mRNA anreichert, obwohl sie rRNA nicht vollständig entfernt.
• mRNA-Profilierung: Wenn Sie Transkriptomik durchführen, um Genexpressionsniveaus oder alternatives Spleißen in kodierenden Regionen zu verstehen, ist die PolyA-Anreicherung effektiv.

Einschränkungen:

• Nicht-polyadenylierte RNAs: Sie erfasst keine nicht-polyadenylierten RNA, wie lange nicht-kodierende RNAs (lncRNAs), miRNAs, rRNAs und einige kleine RNAs.

Überlegungen für minderwertige RNA (PolyA-Anreicherung):

• Reduzierte mRNA-Erfassung: Wenn die mRNA fragmentiert oder degradiert ist, erfasst die PolyA-Anreicherung hauptsächlich das 3'-Ende der mRNA, und es könnte zu einem Verlust wichtiger Daten kommen. Dies ist oft der Fall bei RNA, die aus FFPE-Schnitten extrahiert wurde.
• Moderate Degradation: Die PolyA-Anreicherung kann immer noch nützlich sein, wenn die RNA-Degradation moderat ist (d.h. nicht stark fragmentiert), solange eine ausreichende Menge intakter polyadenylierter RNA vorhanden ist.

2. rRNA-Depletion

Die rRNA-Depletion entfernt den Großteil der ribosomalen RNA (rRNA), die 80-90% der Gesamt-RNA in den meisten eukaryotischen Zellen ausmacht. Durch die Depletion der rRNA können Sie andere RNA-Typen analysieren, die weniger häufig vorkommen, wie mRNA (in Fällen, in denen die PolyA-Anreicherung nicht bevorzugt wird), lncRNAs, kleine RNAs und andere nicht-kodierende RNAs.

Wann sollte man rRNA-Depletion verwenden?

• Umfassende Transkriptomanalyse: Wenn Ihr Ziel darin besteht, alle Arten von RNA zu untersuchen, einschließlich nicht-kodierender RNAs (wie lncRNAs und miRNAs), kleiner RNAs oder sogar nicht-polyadenylierter mRNAs, ist die rRNA-Depletion eine bessere Option, da sie diese RNA-Typen bewahrt.
• Prokaryotische Proben: In Prokaryoten (die rRNA als die häufigste RNA haben) wird die rRNA-Depletion häufig verwendet, um die Qualität der RNA-Seq-Daten zu verbessern, da prokaryotische mRNAs keine PolyA-Schwänze haben.

Einschränkungen:

• Teilweise rRNA-Entfernung: In einigen Fällen entfernen rRNA-Depletionsmethoden möglicherweise nicht alle rRNA-Spezies, sodass einige Restmengen verbleiben.

Überlegungen für minderwertige RNA (rRNA-Depletion)

• Schwere RNA-Degradation: Die rRNA-Depletion eignet sich besser für minderwertige oder degradierte RNA, z.B. RNA, die aus FFPE-Schnitten extrahiert wurde, da sie nicht auf die Integrität der PolyA-Schwänze angewiesen ist. Auch bei fragmentierter RNA kann die rRNA-Depletion die rRNA-Kontamination effektiv reduzieren.

Zusammenfassung:

• PolyA-Anreicherung ist optimal, wenn Sie sich auf mRNA konzentrieren und die RNA-Qualität hoch bis moderat ist. Sie ist weniger effektiv, wenn die RNA degradiert ist oder wenn Sie nicht-polyadenylierte RNAs analysieren müssen.
• rRNA-Depletion funktioniert gut für alle nicht-rRNA-Typen und prokaryotische mRNA, insbesondere wenn Sie ein breiteres Spektrum von RNA erfassen möchten, einschließlich nicht-polyadenylierter RNAs wie lncRNAs. Diese Methode ist auch ideal, wenn Sie mit stark degradierter RNA arbeiten.

Wir bieten rRNA-Depletion unter Verwendung spezialisierter Kits für eine Vielzahl von Organismen an, einschließlich Mensch, Maus, Ratte, Bakterien und Pflanzen. Diese Kits sind darauf ausgelegt, ribosomale RNA effizient zu entfernen, wodurch eine fokussiertere Analyse des Transkriptoms in diesen Spezies ermöglicht wird.

Unser rRNA-Depletionsservice ist mit einer Vielzahl von Säugetierarten kompatibel, obwohl die Depletionseffizienz je nach Art variieren kann. Hier ist eine Zusammenfassung der rRNA-Depletionseffizienzen für mehrere Arten basierend auf Schätzungen:

• Huhn: 82%
• Kuh: 98%
• Javaneraffe (Macaca fascicularis): 88%
• Hund: 90%
• Hamster: 95%
• Pferd: 98%
• Schwein: 80%
• Kaninchen: 81%
• Schaf: 95%

Unser rRNA-Depletionsservice ist mit einer Vielzahl von Pflanzenarten kompatibel, obwohl die Depletionseffizienz je nach Art variieren kann. Hier ist eine Zusammenfassung der rRNA-Depletionseffizienzen für mehrere Arten basierend auf Schätzungen:

• Arabidopsis: 99%
• Gerste: 92%
• Mais: 90%
• Baumwolle: 99%
• Leinsamen: 87%
• Ahorn: 89%
• Hafer: 99%
• Kartoffel: 93%
• Reis: 91%
• Roggen: 99%
• Sorghum: 79%
• Sojabohne: 93%
• Weizen: 94%

Zur Analyse von RNA aus Blutproben empfehlen wir sowohl die rRNA-Depletion als auch die Globin-mRNA-Depletion. Da Globin-mRNA einen erheblichen Anteil der RNA im Blut ausmacht, hilft deren Depletion zusammen mit der rRNA-Depletion, die Probe für andere weniger häufige, aber biologisch relevante RNA-Spezies anzureichern.

Für Ultra-Low Input RNA-Seq verwenden wir die Poly-A-Selektion, um mRNA anzureichern, da sie sehr effektiv darin ist, das Transkriptom aus kleinen RNA-Mengen zu erfassen. Bitte beachten Sie, dass für diesen Service aufgrund der begrenzten Menge an Eingangs-RNA keine rRNA-Depletion verfügbar ist.

Daher ist Ultra-Low Input RNA-Seq nur für eukaryotische RNA verfügbar.

Die erforderliche Anzahl an Reads hängt von Faktoren wie der Größe des Genoms, der Anzahl der bekannten Gene und Transkripte ab. Als allgemeine Richtlinie empfehlen wir:

• 5-10 Millionen Read-Paare pro Probe für kleine Genome (z.B. Bakterien)
• 20-30 Millionen Reads pro Probe für größere Genome (z.B. Mensch, Maus)
• Für mittelgroße Genome (z.B. Hefe) kann die erforderliche Anzahl an Reads je nach Projekt variieren, aber typischerweise schlagen wir 15-20 Millionen Reads pro Probe vor.
• Für de novo Transkriptom-Assemblierungsprojekte empfehlen wir etwa 100 Millionen Reads pro Probe.

Wir stellen Rohdaten als FASTQ-Dateien für alle Projekte zur Verfügung. Darüber hinaus bieten wir fortgeschrittene bioinformatische Dienstleistungen an, die optional zur Datenanalyse genutzt werden können. Die verfügbaren bioinformatischen Dienstleistungen für RNA-Seq-Projekte sind wie folgt:

Standardanalyse:

• Qualitätsbewertung der Sequenzierungsdaten
• Ausrichtung der Reads auf ein Referenzgenom
• Assemblierung und Quantifizierung von Transkripten
• Normalisierung der Genanzahl
• Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Genen
• Hauptkomponentenanalyse (PCA)
• Signifikanztests
• Erstellung detaillierter Berichte und Visualisierungen

Optionale Analyse:

• Analyse des alternativen Spleißens (AS)
• Genfusion-Analyse
• Varianten-Erkennung und deren Auswirkungen auf Proteinveränderungen

Erweiterte Analyse:

• Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA)

Jeder Service umfasst spezifische Ergebnisse und hat damit verbundene Kosten und Bearbeitungszeiten.

Wenn die Gesamt-RNA sequenziert wird, dann erhalten sie eine Vielzahl von RNA-Typen, einschließlich:

• mRNA: Liefert Informationen zur Genexpression.
• rRNA: Dominiert die meisten RNA-Proben, es sei denn, sie wird depletiert.
• tRNA und nicht-kodierende RNAs: Kleinere Mengen, aber sie spielen wichtige regulatorische Rollen.

Ohne spezifische Anreicherung wird rRNA wahrscheinlich die Daten dominieren.

Während des RNA-Seq – Ultra Low Bibliotheksvorbereitungsprozesses werden Primer- und Adaptersequenzen während der cDNA-Synthese und -Amplifikation zur RNA hinzugefügt. Diese Sequenzen sind für den Sequenzierungsprozess notwendig, gehören jedoch nicht zum eigentlichen biologischen Transkript. Wenn sie in den Daten verbleiben, können sie Rauschen verursachen und die Qualität der Sequenzierungsergebnisse verringern. Um hochwertige Daten zu gewährleisten, trimmt Eurofins diese Sequenzen vor der Lieferung, was zu leicht verkürzten Sequenzierungsreads führen kann.