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Allgemeine FAQs im Bereich Next Generation Sequencing >>

Es können alle Bakterien, Archaeen und Pilze identifiziert werden, zu denen eine Sequenz in der NCBI Nukleotid Datenbank publiziert ist. Es gibt momentan zum Beispiel tausende bakterielle Spezies mit Sequenz-Einträgen in der Nukleotid Datenbank. Nah verwandte Arten mit fast identischen DNA-Sequenzen können nicht unterschieden werden. In diesen Fällen wird nur der Genus (oder die Familie) bestimmt.

Mikrobiom-Profiling durch Next-Generation-Sequencing (NGS) ermöglicht die Detektion einer Vielzahl von Spezies, darunter:

• Bakterien: Alle bakteriellen Spezies mit veröffentlichten Sequenzen in der NCBI-Nukleotiddatenbank können identifiziert werden.
• Archaeen: Archaeenspezies, die in der NCBI-Datenbank vertreten sind, können ebenfalls detektiert werden.
• Pilze: Pilzarten können durch die Analyse der Internal Transcribed Spacer (ITS)-Regionen oder der 18S-Region identifiziert werden, sofern ihre Sequenzen in der NCBI-Datenbank verfügbar sind.
• Cyanobakterien: Derzeit ist die Identifizierung von Cyanobakterien aufgrund der Einschränkungen des bestehenden Primer-Setups nicht möglich. Falls Cyanobakterien ein zentraler Fokus Ihrer Studie sind, empfehlen wir die Verwendung alternativer Primer-Sets oder spezifisch entwickelter Methoden zur Amplifikation und Detektion.

Wichtige Hinweise:

• Auflösungsgrenzen: Nah verwandte Spezies mit nahezu identischen DNA-Sequenzen können möglicherweise nicht unterschieden werden. Die Ergebnisse beziehen sich typischerweise nur auf die Gattung- oder Familienebene.
• Probenqualität: Die Qualität der DNA und die spezifischen Zielregionen können die Detektionsmöglichkeiten beeinflussen.
• Datenbankabdeckung: Die Identifizierung von Spezies hängt von der Vollständigkeit und Genauigkeit der Referenzsequenzen in der NCBI-Datenbank ab.

Falsch-Negative Ergebnisse:

• Degradierte DNA: Proben mit stark degradierter DNA können dazu führen, dass keine Spezies identifiziert wird, was zu falsch-negativen Ergebnissen führt.
• Geringe Abundanz: Spezies, die in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden sind (typischerweise unter 0,5 % aller zugeordneten Reads), können möglicherweise nicht erkannt oder gemeldet werden, selbst wenn sie in der Probe vorhanden sind.

Falsch-Positive Ergebnisse:

• Hohe Sensitivität: NGS detektiert alle erfolgreich amplifizierten DNA-Amplicons. Sequenzen mit niedriger Abundanz oder unerwarteter Länge können aufgrund von PCR- oder Sequenzierungsfehlern fälschlicherweise identifiziert werden.
• Filterungsprozess: Um falsch-positive Ergebnisse zu minimieren, werden während der Datenanalyse strenge bioinformatische Filter angewendet.

Negative Kontrollen:

Um falsch-positive Ergebnisse weiter zu reduzieren, wird eine negative Kontrolle (steriles Wasser) parallel zu den Proben analysiert.

Ja, 16S-Primer können manchmal pflanzliche Organellen amplifizieren, insbesondere das 16S-rRNA-Gen, das in den Chloroplasten von Pflanzen vorkommt. Chloroplasten enthalten eigene ribosomale RNA-Gene, die aufgrund ihres evolutionären Ursprungs Bakterien ähneln.

Der Grad der Amplifikation hängt jedoch von mehreren Faktoren ab:

Primerspezifität:
Einige 16S-Primer sind speziell für bakterielle Ziele entwickelt und amplifizieren möglicherweise Chloroplasten-DNA nicht effizient. Andere könnten breiter anwendbar sein und auch Chloroplasten-DNA einschließen.

Probenzusammensetzung:
In Proben mit einer komplexen Mischung von Organismen, wie z. B. Umweltproben, kann das Vorhandensein von Pflanzen-DNA zur Amplifikation von Chloroplasten-Sequenzen führen.

Zielregion:
Verschiedene Regionen des 16S-Gens weisen unterschiedliche Konservierungsgrade zwischen bakterieller und Chloroplasten-DNA auf, was die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Amplifikation beeinflussen kann.

Empfehlung:
Wenn Sie ausschließlich bakterielle Gemeinschaften analysieren möchten und die Amplifikation pflanzlicher Organellen vermeiden wollen, sollten Sie Primer auswählen, die speziell für bakterielle 16S-rRNA-Gene entwickelt wurden.

Richtlinien zur Auswahl von Zielregionen und Anzahl der Targets für 16S-Mikrobiomanalysen:

Auswahl der Zielregionen:
Für eine umfassende mikrobielle Profilierung wählen Sie mindestens eine Zielregion des 16S-rRNA-Gens. Häufig analysierte Regionen sind V1-V3, V3-V4 oder V3-V5. Die Wahl hängt von Ihren Forschungszielen und den spezifischen interessierenden Taxa ab.

Berücksichtigung mehrerer Zielregionen:
Um die Abdeckung zu maximieren und die Vielfalt Ihrer mikrobiellen Gemeinschaft besser zu erfassen, ist es vorteilhaft, mehrere 16S-Zielregionen zu analysieren. Dies kann helfen, die Einschränkungen einzelner Primer-Sets zu kompensieren, da manche Arten möglicherweise nicht effizient amplifiziert werden.

Literaturrecherche:
Prüfen Sie vorhandene Studien und Literatur zu den von Ihnen gewählten Zielregionen. Dies gibt Einblicke in potenzielle Verzerrungen oder Einschränkungen der verschiedenen Primer-Sets und unterstützt Ihre Auswahl.

Probentyp:
Berücksichtigen Sie die Art Ihrer Proben (z. B. Umwelt-, klinische Proben) und deren erwartete Diversität. Komplexere Proben erfordern möglicherweise eine breitere Auswahl an Zielregionen, um die Gemeinschaftsstruktur präzise widerzuspiegeln.

Experimentelles Design:
Wenn Ihre Analyse darauf abzielt, verschiedene Proben oder Bedingungen zu vergleichen, stellen Sie sicher, dass in allen Proben dieselben Zielregionen verwendet werden. Dies gewährleistet Konsistenz bei der Dateninterpretation.

Qualitätskontrolle bei der Amplicon-Generierung und Sequenzierung

• Amplicon-Generierung als primäre Eingangskontrolle: Obwohl unsere PCR-Bedingungen optimiert sind, hängt der Erfolg der Amplicon-Generierung stark von der Menge an bakterieller, archaeeller oder pilzlicher DNA in der Probe ab.
• Qualität der DNA-Extraktion: Wenn wir die DNA extrahieren, wird die Menge der extrahierten DNA mittels Spektrophotometrie bewertet.

Erste Bewertung: Falls kein Amplicon generiert werden kann oder das generierte Amplicon sehr schwach ist, deutet dies stark darauf hin, dass der DNA-Gehalt möglicherweise unzureichend ist.

Negative Kontrollen:

Jede Charge enthält negative Kontrollen (steriles Wasser), um potenzielle Kontaminationen während der Probenvorbereitung zu erkennen.

Qualitätsbewertung der Sequenzierung:

• Überwachung der Lesequalität: Nach der Sequenzierung wird die Qualität der Reads anhand von Metriken wie Q-Scores bewertet, um potenzielle Probleme mit der Sequenziergenauigkeit zu identifizieren.
• Filterung von niedrigqualitativen Reads: Niedrigqualitative Reads und Adapter-Sequenzen werden während der bioinformatischen Analyse entfernt, um die Datenqualität zu verbessern.

Keine Amplicon-Generierung:

Wenn kein Amplicon generiert werden kann, informieren wir Sie und stoppen die Verarbeitung dieser Proben. Für den nicht durchgeführten Sequenzierungsteil wird Ihnen eine Erstattung gewährt.

Schwache Amplicon-Generierung:

Falls nur ein schwaches Amplicon generiert wird, informieren wir Sie ebenfalls. Auf Kundenwunsch kann Eurofins Genomics diese Amplicons dennoch in den Sequenzierungspool aufnehmen. Erfahrungsgemäß resultieren schwache Amplicons jedoch typischerweise in einer sehr geringen Anzahl von Reads. Die Interpretation dieser Reads sollte daher mit Vorsicht erfolgen.

Genetische Variation:
Verschiedene Spezies weisen unterschiedliche Längen der Zielregionen in ihren Genomen auf. Beispielsweise kann das 16S-rRNA-Gen zwischen bakteriellen Spezies erheblich variieren, was zu Unterschieden in den Amplicon-Längen während der Amplifikation führt.

Intraspezifische Diversität:
Selbst innerhalb einer einzigen Spezies können genetische Variationen, wie Polymorphismen oder Mutationen, Unterschiede in den Amplicon-Längen verursachen.

Ja, insbesondere bei menschlichen Proben. Stellen Sie sicher, dass die relevanten ethischen Richtlinien eingehalten werden, und holen Sie die erforderlichen Genehmigungen für Forschungen ein, die menschliche Probanden betreffen.

Häufige Probentypen umfassen Stuhl, Speichel, Hautabstriche, Umweltproben (Boden, Wasser) und mehr. Jeder Probentyp kann spezifische Handhabungsprotokolle erfordern. Bitte konsultieren Sie unseren Leitfaden zur Probeneinreichung für weitere Details.