Re-Sequencing-Projekte werden je nach Bedarf in verschiedenen Projektphasen angeboten.
Phase 0: Extraktion genomischer DNA / RNA aus Gewebe / Bakterien / Pilzen
Die Isolierung genomischer DNA aus Ausgangsmaterial wird unter Verwendung eines kommerziellen Kits durchgeführt. Das Kit arbeitet auf der Grundlage einer Probenlyse unter stark denaturierenden Bedingungen in Kombination mit einer selektiven und reversiblen DNA-Bindung an Silikamembranen. Qualität und Quantität der eluierten DNA werden durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft.
Phase I: Etablierung
PCR Primer Design und Synthese
Die bereitgestellten Sequenzinformationen werden verwendet, um die geeigneten Primer zu entwerfen, die für die PCR-Reaktionen erforderlich sind. Alle Primer sind optimiert und ihre physikalischen Eigenschaften wie GC-Gehalt, Tm und Selbstannealing werden von unserem Expertenteam verifiziert. Primer werden anschließend im eigenen Haus synthetisiert.
PCR und Aufreinigung
PCR-Reaktionen werden basierend auf einer genomischen Standard-DNA (sofern verfügbar) oder auf einer oder zwei von Ihnen bereitgestellten genomischen DNA-Proben erstellt. Die PCR-Produkte werden später mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgereinigt und qualitätsgeprüft. Alle PCR-Produkte mit unbefriedigenden Ergebnissen werden ggf. ein zweites oder drittes Mal regeneriert. Die Regeneration umfasst ein neues Primerdesign für jedes PCR-Produkt, Primersynthese, PCR-Amplifikation und Aufreinigung der PCR-Produkte.
Sequenzierung der Test-PCR
Um die Qualität des PCR-Prozesses sicherzustellen, werden anschließend alle etablierten PCR-Reaktionen von beiden Seiten sequenziert.
Phase II: Hochdurchsatz-PCR & Sequenzierung
Hochdurchsatz-PCR und Aufreinigung
Nach erfolgreichem PCR-Primer-Design werden PCR-Reaktionen mit allen genomischen DNA-Proben angesetzt und im Hochdurchsatz durchgeführt. Für die 16S- und ITS-Sequenzierung werden spezifische Primer verwendet. Die PCR-Produkte werden anschließend gereinigt und über Agarosegel qualitätsgeprüft.
Hochdurchsatz-Sequenzierung
Alle PCR-Produkte werden in Doppelstrangqualität sequenziert. Dieser Schritt beinhaltet eine Wiederholung der Sequenzierungsreaktion, falls eine Reaktion fehlschlägt. Wenn beide Reaktionen fehlschlagen, wird die PCR-Amplifikation für diese Probe wiederholt
Phase III: Bioinformatische Analyse
Die Bioinformatik umfasst die Analyse der einzelnen Reads, Qualitäts-Clipping und Assemblierung, um eine Konsensusequenz jeder Probe / jedes Gens zu erstellen. Auf Anfrage verwenden wir die erhaltenen Konsensussequenzen, um eine Datenbanksuche (BLAST) durchzuführen, um die biologische Klassifizierung jeder Probe durchzuführen.
Jede Sequenz kann mit einer vom Kunden bereitgestellten Referenzsequenz verglichen und analysiert werden, um potenzielle Sequenzunterschiede wie Heterozygoten, Insertionen/Deletionen oder Codon-Änderungen zu finden.
Um einen vollständigen Mutationsbericht zu erstellen, können wir eine Analyse mit geeigneter Software durchführen.
Die Sequenzierung durch Primer-Walking ermöglicht eine präzise Sequenzidentifikation langer Fragmente mit höchster Genauigkeit
Die De-novo-Sequenzierung erfordert typischerweise die Sequenzierung beider Stränge.
Es beginnt mit der Verwendung von Standard- oder spezifischen Primern, ausgehend von gemeinsamen Elementen (z.B. Ursprung der Replikation oder des Resistenzgens), um die ersten 750–1000 Basen des gelieferten PCR-Produkts, Plasmids oder der BAC-, PAC-, Cosmid-, Fosmid-DNA von beiden Seiten zu sequenzieren. Basierend auf den resultierenden Sequenzdaten definieren und synthetisieren wir neue Primer, die verwendet werden, um weitere Basen zu sequenzieren und so entlang der Sequenz zu „wandern“. Die interessierende Region wird bi-direktional sequenziert, bis beide Stränge vollständig entschlüsselt sind (2-fache oder 4-fache Sequenzabdeckung).
Wenn es irgendwelche Zweideutigkeiten in der Sequenz gibt, werden weitere Primer entworfen, um diese aufzulösen. Dieser Prozess gewährleistet die höchste Datengenauigkeit von 99.9% bei der Einzelstrangstrangsequenzierung und 99.999% bei der Doppelstrangsequenzierung was weniger als einen Fehler in 100.000 Basenpaaren entspricht.
Unser Primer Walking Service beinhaltet:
- Plasmid-DNA-Extraktion im Tube-Format (optional)
- PCR-Produktreinigung im Tube-Format (optional)
- Qualitätskontrolle der eingehenden DNA
- Überprüfung der bereitgestellten Referenzsequenz
- Design und Synthese spezifischer Primer
- Bioinformatische Analyse mit entsprechender Software inkl.:
- Assemblierung der Sequenzdaten zur Generierung einer Konsensussequenz
- Qualitätsprüfung der Konsensussequenz inkl. Qualitätsbericht
- Verifizierungsgenauigkeit von >99.9% durch Einzelstrangsequenzierung
- Verifizierungsgenauigkeit von >99.999% durch Doppelstrangsequenzierung
- Kostenlose Aufbewahrung von Template-DNA und allen Primern für 3 Monate
- Lieferzeit: 2 kb innerhalb von 6-8 Werktagen
Die TOPO-TA-Klonierung von PCR-Produkten mit anschließender Sequenzierung wird je nach Bedarf in verschiedenen Projektphasen angeboten.
Phase 0: Aufeinigung von PCR-Produkten
Auf Wunsch führen wir die Aufeinigung von ungereinigten PCR-Produkten durch, indem wir einen Ethanol-Präzipitationsschritt unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG) durchführen.
Phase I: Klonierung in einen Vektor und Plattierung
Die gelieferten Proben werden mit einem kommerziellen Klonierungs-Kit in einen geeigneten Vektor kloniert. Für die Transformation werden chemisch kompetente E.coli-Zellen verwendet. Die Zellen werden ausplattiert und auf LB-Agarplatten gezüchtet, die geeignete Antibiotika enthalten. Bei unbefriedigenden Ergebnissen (z. B. gar keine Klone oder nur blaue Klone) wird die Klonierungs-Reaktion einmal wiederholt.
Phase II: Picken der Klone, DNA-Präparation und Hochdurchsatz-Sequenzierung
Nach dem Ausplattieren und Züchten wird die angegebene Anzahl von Einzelzellklonen pro PCR-Produkt gepickt, gezüchtet und die Plasmid-Minipräparation wird unter Verwendung eines kommerziellen Kits durchgeführt. Die gereinigte Plasmid-DNA wird als Matrize verwendet, um das jeweilige Insert mit zwei (Doppelstrang) Standardprimern (z. B. M13for- und M13rev) zu sequenzieren. Bei Misserfolg wird die Sequenzierung einmal mit alternativen Primern wiederholt.
Phase III: Bioinformatische Analyse
Auf Wunsch umfasst die Bioinformatik das Clipping von Vektorsequenzen und das Alignment einzelner Reads, um eine Konsensussequenz des Inserts zu erstellen.
Auf Wunsch vergleichen wir auch jede Sequenz mit einer oder mehreren Referenzsequenzen, die vom Kunden bereitgestellt werden. Diese werden analysiert, um mögliche Sequenzunterschiede wie Heterozygoten, Insertionen/Deletionen oder Codon-Änderungen zu finden.
Um einen vollständigen Mutationsbericht zu erstellen, führen wir eine Analyse mit geeigneter Software durch.
Alle Sanger-Sequenzierungsprojekte können in Übereinstimmung mit "Good Laboratory Practice" (GLP) durchgeführt werden
Neben den Leistungsbeschreibungen für Re-Sequencing- und Primer-Walking-Projekte sind folgende Leistungen für die Sequenzierung unter GLP enthalten:
- Studienplanerstellung inkl. Beschreibung der Materialien und Methoden (inkl. einer Überarbeitung nach Prüfung des Auftraggebers)
- Auswertung und Dokumentation der Sequenzierungsergebnisse.
- Bereitstellung einer Übersichtstabelle (eingebettet in den Studienbericht, falls möglich), in der mögliche Sequenzvariationen aufgeführt sind
- Erstellung des Studienberichts inkl. GLP-Konformitätserklärung (inkl. einer Überarbeitung nach Prüfung durch den Sponsor)
- Studienkontrolle durch QA und Qualitätssicherungserklärung
- Archivierung der Studiendaten / Dokumentation für 15 Jahre
Um die Qualität unseres GLP-Sequenzierungsservice sicherzustellen, werden wir routinemäßig von einem ersten und zweiten externen Auditor bewertet. Darüber hinaus führen wir regelmäßig Anlagen- und Prozessaudits durch.
Referenzen:
Die Sequenzierung erfolgt nach Standardmethoden gemäß:
CLSI Guideline MM09-A; Vol. 34 No. 4, 2014; Nucleic Acid Sequencing Methods in Diagnostic Laboratory Medicine, Approved Guideline-Second Edition
Die Durchführung von Sequenzierungsstudien erfolgt gemäß:
OECD Guideline ENV/MC/CHEM(98)17 (rev.1999): The Principles of Good Laboratory Praxis (Monograph No. 01) and OECD Guideline ENV/JM/MONO(1999)23 (rev. 2002): Short Term Study and GLP (Monograph No. 07)
Qualitätssicherungsaktivitäten (QA) im Zusammenhang mit Sequenzierungsstudien (Überprüfung des Studienplans, Inspektion der Studie, des Studienberichts und der Rohdaten) werden durchgeführt gemäß:
OECD Guideline ENV/JM/MONO (1999) 20 (03-October-2002): Quality Assurance and GLP
Re-Sequencing-Projekte inkl. 16S / ITS-Sequenzierungsprojekte:
Sie erhalten Sequenzdaten als FASTA-Datenbanken sowie die Traces aller Sequenzläufe im *ab1-Dateiformat.
Wenn eine bioinformatische Analyse bestellt wird, werden Konsensussequenzen jeder Probe bzw. ein vollständiger Mutationsbericht unter Verwendung einer speziellen Software bereitgestellt.
Wenn eine BLAST-Analyse bestellt wird, melden wir die Arten, die den BLAST-Suchergebnissen mit der höchsten Punktzahl für jede Probe entsprechen. Treten im taxonomischen Ranking zu viele Unklarheiten auf, melden wir nach Möglichkeit die entsprechende Gattung oder zumindest die Familie. Ein tabellarischer BLAST-Bericht wird generiert.
Die Daten werden in Ihrem Online-Konto zur Verfügung gestellt.
Primer Walking Projekte:
Sie erhalten folgende Originaldaten in Ihrem Online-Account:
- *.ab1: electropherograms in AB1 format
- *.cons: consensus sequence in FASTA format (MS-DOS TXT)
- *.qual: quality report for each consensus sequence (MS-DOS TXT)
- *.align: alignment of single reads to build a consensus (MS-DOS TXT)
- *.comp: alignment comparison to a reference sequence (MS-DOS TXT)
- *.mutation: tabular summary of all observed differences to the reference sequence (XLS or MS-DOS TXT)