Saubere, kontrollierte Labore für die SARS-COV-2 Diagnostik und Forschung

Eurofins Genomics betreibt weltweit 6 Produktionsstätten, darunter Niederlassungen in Europa, USA, Japan und Indien. Jede Produktionsstätte produziert unter strengen Qualitätskontrollen SARS-CoV-2-Materialien für die Diagnostik und für Forschungszwecke. Eurofins Genomics ist nach ISO 13485, ISO 9001 und GMP akkreditiert und verfügt zusätzlich über akkreditierte Labore (CLIA & CAP) für klinische Projekte. Darüber hinaus werden alle Gen- und Genfragmente in komplett getrennten Einrichtungen von der DNA-Oligo-Produktion hergestellt, um das Risiko einer Kreuzkontamination zu verringern. Darüber hinaus haben alle Oligo-Produktionen von Eurofins Genomics Maßnahmen getroffen für jedes Oligo-Produkt eigene Prozesse und eigene Maschinen zu verwenden, um mögliche Kreuzkonterminationen zu COVID-19 Sequenzen zu vermeiden. Eurofins Genomics ist stolz darauf, während der SARS-CoV-2-Krise ein führender Anbieter von dafür benötigten Produkten zu sein.

Das Coronavirus SARS-CoV-2 und die daraus resultierende Krankheit COVID-19 haben fast jedes Land der Erde erreicht. Im Vergleich zu anderen Infektionskrankheiten wie der Grippe gibt es jedoch noch viele Unbekannte über SARS-CoV-2. Wissenschaftler auf der ganzen Welt erforschen das Virus unermüdlich, um es besser zu verstehen und um Behandlungen zu finden. Was ist derzeit über die Genomik von SARS-Cov-2 bekannt und wie werden die Informationen in der Diagnostik verwendet?

Was für ein Virus ist SARS-CoV-2?

SARS-CoV-2 ist ein RNA-Virus und gehört zur Familie der Coronaviridae und der Gattung Betacoronavirus. Sein Genom besteht aus einer einzelsträngigen Positiv-Sense-RNA. Die Besonderheit von einzelsträngiger Positiv-Sense-RNA besteht darin, dass sie direkt als mRNA in der Wirtszelle fungieren kann und daher direkt translatiert wird. Im Gegensatz dazu muss die RNA eines einzelsträngigen Negativ-Sense-RNA-Virus zunächst in Positiv-Sense-RNA umgewandelt werden, um translatiert zu werden (Abbildung 1).

Was sind die Gene von SARS-CoV-2?

Das RNA-Genom von SARS-CoV-2 ist ungefähr 30.000 Nukleotide lang und codiert 27 nichtstrukturelle Proteine und 4 strukturelle Proteine. Die 27 nichtstrukturellen Proteine umfassen RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRP), von der festgestellt wurde, dass sie stark ähnliche Teile der RdRP-Gen des Coronavirus RaTG13 in Fledermäusen. Andere nichtstrukturelle Proteine sind beispielsweise Proteasen und Helikasen. Die 4 Gene, die für Strukturproteine kodieren, die im Wesentlichen die Hülle des Virus bilden, sind: 1. das Spike-Oberflächenglykoprotein des Virus (S), 2. das Matrixprotein (M), 3. das Nucleocapsid-Protein (N) und 3. das Hüllprotein (E) (Abbildung 2).

Die Spike-Proteine auf der Oberfläche des Virus scheinen die Bindung des Virus an den Angiotensin-Converting-Enzym-2 (ACE2) -Rezeptor von Wirtszellen und den Eintritt in die Wirtszellen zu vermitteln. Das M-Protein scheint an der Bildung der Kugel beteiligt zu sein. Das N-Protein, auch Nucleoprotein genannt, ist mit der einzelsträngigen RNA assoziiert und bildet zusammen das Nucleocapsid. Das E-Protein ist das kleinste der 4 Strukturproteine. Die genomische Zusammensetzung von SARS-CoV- 2 wurde analysiert und die Sequenz ist im GenBank-Sequenz-Repository öffentlich verfügbar. Bis jetzt wurden 104 Stämme von SARS-CoV-2 isoliert und sequenziert.

Wie wird SARS-CoV-2 identifiziert?

Es hat sich gezeigt, dass molekulare Techniken zur Identifizierung von SARS-CoV-2-Infektionen sehr gut geeignet sind. Speziell die Echtzeit-RT-PCR (qRT-PCR) wird zur Analyse von Atemwegsproben verwendet. Hier wird die RNA von SARS-CoV-2 aus den Atmungsproben extrahiert und anschließend revers in komplementäre DNA (cDNA) transkribiert. Die cDNA wird dann für die Echtzeit-PCR-Amplifikation mit spezifischen Primern und Sonden verwendet, die auf drei Regionen des viralen Genoms abzielen:

• Das RdRP-Gen, das sich im offenen Leserahmen ORF1ab befindet.
• Das E-Gen
• Das N-Gen

Es wurde vermutet, dass das RdRP-Gen und die E-Gene eine etwas höhere analytische Empfindlichkeit aufweisen als das N-Gen.
Zu Identifikationszwecken wurde vorgeschlagen, Assays zu verwenden, die auf zwei Regionen abzielen. Ein Primerpaar zur Identifizierung eines breiteren Spektrums von Coronaviren, einschließlich SARS-CoV-2, und ein Primerpaar, das für SARS-CoV-2 spezifisch ist:

• Die Empfehlung einer Forschungsgruppe der Charité Universitätsmedizin Berlin, die der WHO-Empfehlung zugrunde liegt, lautet, zunächst ein Primerpaar zu verwenden, das auf verschiedene Regionen des E-Gens abzielt, um alle SARS-verwandte Viren nachzuweisen. Falls dies zu einer Amplifikation führt, wird eine zweite Analyse mit einem Primerpaar, das auf verschiedene Regionen des RdRP-Gens abzielt, als Bestätigungstest durchgeführt.
• Die Verwendung eines Primerpaars, das auf das N-Gen abzielt, und eines Primerpaars, das auf das ORF1b / RNAse P-Gen abzielt, um die Ergebnisse zu bestätigen, wurde ebenfalls vorgeschlagen und wird von den Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten (CDC) empfohlen (Abbildung 3).

Abb. 3: Genomische Organisation von SARS-CoV-2

qRT-PCR kann in einem einstufigen oder einem zweistufigen Assay durchgeführt werden. Der Ein-Schritt-Assay mit reverser Transkription und PCR-Amplifikation in einer Reaktion ist schnell und liefert reproduzierbare Ergebnisse für die Hochdurchsatzanalyse:

• Die CDC verwendet einen einstufigen qRT-PCR-Assay zum Nachweis eines SARS-CoV-2 in Proben. Hier werden Primer und eine Fluorophor-Quencherprobe Black Hole Quencher-1 (BHQ1) und Fluoresceinamidit (FAM) verwendet. Während der Amplifikation wird die Fluorophor-Quencher-Sonde gespalten, was zur Emission eines Fluoreszenzsignals führt.
• Die Charité Universitätsmedizin Berlin berichtete, dass sie auch einen einstufigen qRT-PCR-Assay verwendet. Hier enthielten die Sonden für den Assay Blackberry Quencher (BBQ) und 6-Carboxyfluorescein (6-FAM).

Der zweistufige Assay, bei dem die reverse Transkription und die PCR-Amplifikation in verschiedenen Röhrchen durchgeführt werden, ist im Allgemeinen empfindlicher, erfordert jedoch mehr Zeit. Die Verwendung von qRT-PCR-Assays erfordert positive Kontrollen für gültige und zuverlässige Analysen.

Was sind die positiven Kontrollen für die SARS-CoV-2-Identifizierung durch qRT-PCR?

Eine Reihe validierter Positivkontrollen als Plasmide, die alle von CDC und WHO empfohlenen SARS-CoV-2-Gene enthalten, wird ebenfalls bereitgestellt: Kontrollplasmide für die Coronavirus-Forschung.

Referenzen

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