Die passende Antwort auf häufig gestellte Fragen
Finden Sie erklärende Informationen zu unseren Produkten und Dienstleistungen, indem Sie auf die folgenden Links klicken.
Kann ich meine Proben auch ohne den kostenlosen Barcode schicken?
Leider nicht. Dieser Barcode wird für unsere internen Laborprozesse benötigt und ist wesentlich, um sicherzustellen, dass wir Ihre Proben so effizient wie möglich bearbeiten können. Vielen Dank für Ihre Mitarbeit!
Wie sollen die Fehler bewertet werden, die ich einer Homopolymeregion oder an einer Dam- oder Dcm-Methylierungsstelle entdeckt habe?
Die vorherrschenden Fehlermodi beim Oxford Nanopore-Sequenzieren umfassen Deletionen innerhalb von Homopolymer-Bereichen, Fehler, die an der zentralen Position der Dcm-Methylierungsstelle CCTGG oder CCAGG auftreten, sowie Fehler an der Dam-Methylierungsstelle GATC.
Bitte behandeln Sie diese Regionen daher besonders sorgfältig.
Warum fehlen einige terminalen Nukleotide in meiner linearen Amplikon-Konsensussequenz?
Abhängig von der Sequenz Ihres Probenmaterials kann der Assembler gelegentlich Schwierigkeiten bei der Rekonstruktion der terminalen Enden von linearer DNA haben, was dazu führen kann, dass bis zu 10 Nukleotiden an den 3'- und/oder 5'-Enden Ihres Inserts fehlen.
Wenn Sie dieses Problem bei Ihren Proben feststellen, können Sie die Rohdaten von Ihrem Dashboard herunterladen und die Enden mit Ihrer bevorzugten Methode rekonstruieren.
Werden meine Amplikons nochmals sequenziert, wenn kein Ergebnis erzielt wird?
Für jeden Lauf führen wir mehrere Qualitätskontrollmessungen durch, um den Erfolg der Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung zu bewerten. Wenn alle Messungen zufriedenstellende Ergebnisse zeigen, werden wir Proben, die fehlgeschlagen sind, nicht erneut bearbeiten.
Mit welcher Sequenzabdeckung kann ich für meine klonalen Amplicons rechnen?
Wir bieten keine spezifische Abdeckungsgarantie an. Die Anzahl der generierten Rohdaten kann erheblich je nach Probenqualität variieren. Erfolgreiche Proben, die in der erforderlichen Konzentration eingesendet werden, ergeben in der Regel eine Anzahl von Rohsequenzierungsdaten im Bereich von Dutzenden bis zu Hunderten (oder sogar Tausenden).
Die durchschnittliche Abdeckung Ihrer Probe ist im Ergebnisbericht HTML enthalten, wobei eine Abdeckung von über ~20x auf einen sehr genauen Konsens hinweist.
Kann ich Mischungen von Amplicons einsenden?
Unser Amplicon-Service ist auf eine Population von Molekülen ausgelegt, die klonal ist.
Was passiert, wenn Sie Mischungen einsenden?
Wenn Ihre Arten ausreichend unterschiedlich sind (zum Beispiel in Größe oder Sequenz stark unterschiedlich), wird der Ablauf zunächst versuchen, eine .fasta-Konsensdatei aus der am häufigsten vorkommenden Art zu erstellen. Es wird auch versucht, einen Konsens für andere Arten zu erstellen, deren Lesanzahlen mehr als 20% derjenigen der am häufigsten vorkommenden Art entsprechen. Letztendlich hängt es von der Gesamtqualität der Probe, der Abdeckung und der relativen Häufigkeit/Abbau jeder Art ab, welche Arten einen Konsens erzeugen.
Wie kann ich meine Amplicon-Mischung sequenzieren lassen?
Eurofins Genomics bietet ein umfangreiches Portfolio für die Sequenzierung von Amplicons. Sie werden definitiv den passenden Service für Ihre Bedürfnisse finden: Amplicon-Portfolio >>
Sind Kontaminationen zwischen Proben möglich (Index-Hopping oder Carry-over-Kontamination)?
- Um unser wettbewerbsfähiges Produkt anbieten zu können, bündeln wir verschiedene Proben in Flowcell-Läufen und verwenden Flowcells nach dem Waschen zwischen den Läufen erneut. Beide Verfahren sind Industriestandard und werden gemäß den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt.
- Durch das Barcode-Tagging und Pooling von Proben auf einer einzelnen Flowcell werden die Kosten gesenkt und die Nutzungseffizienz der Poren maximiert. Allerdings hat die Nanopore-Sequenzierung eine höhere Fehlerquote im Vergleich zur „traditionellen“ Next-Generation-Sequenzierung mit kurzen Reads, was zu Fehlinterpretationen in der Barcode-Sequenz und falscher Probenzusweisung/de-Multiplexierung mit einer Rate von bis zu 0,05% führen kann. Dieses Problem ist als Index-Hopping bekannt.
- Das Flowcell-Waschverfahren ist sehr effektiv, wobei nur bis zu 0,1% einer zuvor geladenen Probe eine nachfolgende Laufkontamination verursachen (bekannt als Carry-over-Kontamination), dennoch können einzelne kontaminierende Reads in Ihren Rohdaten auftreten.
- Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass bei sowohl Index-Hopping als auch Carry-over eine Kontamination dieses Niveaus die endgültige Sequenzassemblierung wahrscheinlich nicht beeinflusst, da mehrere fein abgestimmte Reinigungs- und Filterungsschritte angewendet werden, vorausgesetzt, Ihre Probe erfüllt unsere Qualitäts- und Quantitätsstandards und liefert daher eine ausreichende Anzahl an qualitativ hochwertigen Amplikon-Reads. Es ist wichtig zu beachten, dass das Problem bei Assemblierungen mit geringer Abdeckung am auffälligsten ist (siehe ‚Was ist die Abdeckung?‘).
- Falls Kundenproben nicht unseren Spezifikationen entsprechen, werden die Proben auf eigenes Risiko des Kunden sequenziert, und wir übernehmen keine Haftung für mögliche Schäden.
- Wenn Sie Bedenken bezüglich Kontaminationen haben und insbesondere darüber, dass Reads Ihrer Proben in den Rohdaten anderer Kunden erscheinen, bieten wir die Möglichkeit, unsere Premium-ONT-Dienste zu nutzen, die die Verwendung einer dedizierten vollständigen Flowcell für einzelne Kunden beinhalten (mehr erfahren >>).
Kann ich auch ssDNA Moleküle für den Clonal Amplicon Service schicken?
Nein leider nicht. Unser Protokoll für den Hochdurchsatz von Amplikons ist nur für doppelsträngige DNA ausgelegt.
Aber natürlich haben wir ein weiteres Produkt das jegliche kundenspezifische Anpassung zulässt. Hier erfahren sie mehr >>
Was ist die Sequenz-Abdeckung?
Es hängt wirklich von der Probenqualität ab. Wir können den Deckungsgrad derzeit nicht garantieren. Eine ordnungsgemäß eingereichte gute Probe ergibt normalerweise Hunderte oder sogar Tausende von Sequenzierungs-Reads. Die Konsensabdeckung hängt davon ab, wie viele Reads Volllängen-Amplikons sind und wie viele, falls vorhanden, abgebaut sind.
Eine Abdeckung unter 20x kann ungenau zusammengesetzte Amplikonsequenzen enthalten. Die häufigsten Gründe für Abdeckungen mit niedriger Qualität sind im Abschnitt "Fehlerbehebung bei fehlgeschlagenen Proben" aufgeführt.