Schnell und Präzise zum Ziel mit Primer Walking

Einzel- oder Doppelstrang-Sequenzierung mittels Primer Walking

Sequenzierung mittels Primer Walking ermöglicht die schnelle und präzise Analyse langer Fragmente in höchster Genauigkeit.

Dieser Service beginnt mit der Sequenzierung der ersten 750 - 1.000 Basen von einer oder beiden Seiten des gelieferten PCR Produkts, Plasmids oder BAC, PAC, Cosmid, Fosmid DNA mit standard- oder spezifischen Primern. Auf der Basis der hierbei ermittelten Sequenz definieren und synthesieren wir neue Primer, die dann für die Sequenzierung weiterer Basen verwendet werden, bis die gesamte Sequenz entschlüsselt ist.

Einzelstrang-Sequenzierung
Die von Ihnen gewünschte Region der DNA Sequenz wird einzelsträngig sequenziert. Eine Datengenauigkeit von > 99,9% wird hierbei garantiert.

Doppelstrang-Sequenzierung
Zur Identifizierung komplett unbekannter Sequenzen wird in der Regel die präzise Sequenzierung beider Stränge benötigt. Die von Ihnen gewünschte Region der DNA Sequenz wird doppelsträngig sequenziert, bis beide DNA-Stränge entschlüsselt sind. Falls die Sequenzdaten noch etwaige Ungenauigkeiten aufzeigen sollten, werden neue Primer definiert und diese Region(en) erneut sequenziert bis eine Datengenauigkeit von > 99,999% erreicht wird. 

Unser Primer Walking Service beinhaltet

• Qualitätskontrolle Ihrer eingesendeten DNA
• Verifizierung der mitgelieferten Referenzsequenz
• Design und Synthese spezifischer Primer
• Assemblierung der Sequenzdaten
• Check der Konsensussequenz inkl. Qualitätsbericht
• Kostenlose Lagerung Ihrer Proben und Primer für 3 Monate
• Anfertigung eines Projekberichts wenn gewünscht 
• Lieferzeit: 2 kb innerhalb von 6-8 Arbeitstagen

Wenn Sie uns eine Referenzsequenz mitschicken, geht es noch schneller, da wir gleich von Beginn mehrere Primer definieren können.

Probenvorbereitung für den Primer Walking Service

Bitte senden Sie uns Ihre Proben ausschließlich wie unten beschrieben; das hilft uns dabei, Sie noch besser zu unterstützen und liefert noch präzisere Ergebnisse.

Generell gilt für Ihren Versand:

• Verwenden Sie 1,5ml „Safe Lock“-Tubes für Ihre Proben und Primer
• Verkleben oder umwickeln Sie Ihre Tubes nicht mit Parafilm. „Safe Lock“-Tubes sind viel besser geeignet, denn sie schließen perfekt ab und schützen vor Verdunstung.
• Etikettieren Sie Ihre Template- und Primer-Tubes mit unseren Tube Etiketten
• Verwenden Sie wasserfesten Marker für alle zusätzlichen Kennzeichnungen auf Proben- und Primer-Tubes
• Schicken Sie uns gleich eine Referenzsequenz mit; so können wir von Anfang an gleich mehrere Primer definieren.

Probenvorbereitung

Bitte liefern Sie uns Ihre Proben in folgender Konzentration und Volumen:

Quantifizieren Sie die Template-Konzentration mittels Agarosegel oder Photometer zur Sicherstellung präziser Ergebnisse.

Sequenzier-Primer

Optimale Primer-Bedingungen:

• Primer dürfen keine Phosphorylierung oder Fluoreszenzfarbstoffe enthalten
• Die optimale Primerlänge liegt zwischen 16 und 25 Basen
• Die Schmelztemperatur des Primers sollte 50 - 62°C betragen
• Der GC-Gehalt des Primers sollte bei 35-60 % liegen
• Idealerweise sollte ein G oder C am 3’-Erende liegen
• Die Anzahl der 3' Gs oder Cs sollte nicht größer als 2 Gs oder Cs sein
• Wenn möglich, vermeiden Sie >3 identische Basen hintereinander in der Sequenz

Primer-Konzentration und -Volumen:

• Pro Sequenzierreaktion werden exakt 10 pmol/µl Primerkonzentration benötigt
• Jeder Primer muss ein Gesamtvolumen von 15 µl (in bi-destilliertem Wasser oder 5mM Tris-HCl) haben; für jede weitere Sequenzierreaktion sind 5 µl Primer-Volumen erforderlich
• Die Konzentration von Primern mit Wobbles muss mit dem Faktor n multipliziert werden: n^X x Conc_Primer
  
  n = Anzahl Basen im Wobble gem. IUPC-Code, X = Anzahl Wobbles in der Primer-Sequenz. [z.B. 1 V (AGC) = 3¹ x 10 pmol/µl; 2 V (AGC) (AGC) = 3² x 10 pmol/µl]